基于网络药理学和分子对接研究虫草素抗癌的分子机制

武亭宇，郑 雅，王博龙

宜春学院化学与生物工程学院(江西 宜春 336000)

据中华医学会2018年的报告，我国每年新增癌症患者309万，癌症死亡人数196万，分别占全球新增癌症病例和死亡人数的22%和27%[1]。自2003年以来，中国抗癌药品市场规模同比整体上均保持了两位数的增长，总额从2003年的121亿一路攀升到2015年的近1 000亿[2]。虽然临床上使用的抗癌药物种类繁多，但大多数药物价格高昂，有严重的毒副作用。因此，寻找疗效确切、作用机制清楚、毒副作用小的抗癌药物是医药工作者奋斗的目标之一。

虫草素(Cordycepin)也称3’-脱氧腺苷(3’-Deoxyadenosine)，是从蛹虫草发酵液中提取的一种含氮配糖体的核酸衍生物，属嘌呤类生物碱。研究发现[3]虫草素具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、降血糖、降血脂、免疫调节等多种药理作用。其抗癌作用尤为显著，对人的白血病细胞、肝癌细胞、鼻咽癌KB细胞、Lewis肺癌、宫颈癌HeLa细胞等多种癌细胞均能产生明显的抑制作用[4-5]，但具体作用机制却不甚清楚。本研究应用网络药理学挖掘虫草素的抗癌靶点，进行靶点的蛋白互作分析、基因本体(GO)功能分析，以及京都靶点与靶点组百科全书(KEGG)通路分析，并对主要靶点进行分子对接验证，以期全面阐明虫草素的抗癌机制。

1 材料与方法

1.1数据库与软件①活性成分靶点数据库：BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、CTD(http://ctdbase.org/)；②疾病靶点数据库：GeneCards(https://www.genecards.org/)、Open Targets Platform(https://www.targetvalidation.org)；③蛋白质相互作用分析平台：STRING(https://string-db.org/)；④生信在线分析平台：OmicShare(http://omicshare.com/)、R软件(version 3.6.1)；⑤网络分析及作图软件Cytoscape 3.7.2、Venny 2.1.0(https://bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny/index.html)；⑥化合物及蛋白结构数据库及软件：ChemicalBook(https://www.chemicalbook.com/ProductIndex.aspx)、ChemBio3D、PDB(http://www.rcsb.org/)；⑦分子对接相关软件：分子三维结构处理软件PyMOL、AutoDuck Vina[5]及AutoDuck Tools。

1.2虫草素靶点集合筛选在BATMAN-TCM数据库中输入“CHONG CAO SU”，设置靶点分阈值为20，P≤0.05，搜索获取虫草素靶点。在CTD数据库中，关键词设置为“Chemicals”，输入“Cordycepin”，搜索虫草素靶点。将以上两个数据库的靶点合并去重得到虫草素靶点。

1.3癌症靶点筛选及虫草素抗癌靶点网络构建分别在GeneCards、OpenTargets Platform数据库输入关键词“cancer”，检索癌症相关靶点，将以上数据库获取的癌症靶点按照相关度打分，从高到低依次选分数前2 000个靶点。再将两个数据库的癌症靶点与虫草素靶点输入Venny 2.1.0软件，取三者交集作为虫草素抗癌靶点，将虫草素及其抗癌靶点导入 Cytoscape3.7.2 软件构建虫草素-抗癌靶点网络。

1.4虫草素抗癌靶点相互作用(PPI)网络构建将1.3中所获得的虫草素抗癌靶点导入STRING平台构建蛋白PPI，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值“medium confidence=0.4”，其他参数保持默认值。将 PPI 网络导入Cytoscape 3.7.2软件，利用“Network Analysis”功能计算各网络节点的度值(Degree)、介数(Betweenness)及最短路径(Closeness)等拓扑参数，节点的Degree、Betweenness、Closeness数值越大，该节点在网络中的位置就越重要[6]。选取Degree、Betweenness、Closeness同时在平均值之上的靶点作为虫草素抗癌的主要靶点。

1.5虫草素抗癌靶点的GO功能和KEGG通路富集分析将虫草素抗癌靶点的名称在ensembl网站(http://www.ensembl.org/biomart/martview)转换为相应的靶点ID后，运用OmicShare云平台进行动态GO富集分析。运用R软件，将虫草素抗癌靶点转换为Gene Symbol后，采用R软件“clusterProfiler”插件进行虫草素抗癌靶点的KEGG通路富集分析。

1.6虫草素与癌症主要靶点的分子对接验证在ChemicalBook数据库获取虫草素的2D结构，将其导入ChemBio3D后，以mol2的格式保存其3D结构。在PDB数据库搜索虫草素抗癌的靶点蛋白晶体复合物，借助PyMOL软件去除蛋白中的水分子、磷酸根及多余的非活性配体，分离靶蛋白与原配体。将分离后的靶蛋白导入AutoDuck Tools软件进行加氢、加电荷等操作。再将靶蛋白、虫草素、原配体统一在AutoDuck Tools中转换成pdbqt格式。以原配体所在位点为活性口袋进行分子对接，对比分析原配体及虫草素与靶蛋白的亲和力。

2 结果

2.1虫草素抗癌靶点及其网络将BATMAN-TCM、CTD数据库中检索到的靶点合并去重，得到虫草素靶点107个。将虫草素靶点与GeneCards、OpenTargets Platform的癌症靶点导入Venny 2.1.0软件，去重得到31个虫草素抗癌靶点(图1)。将虫草素及31个抗癌靶点导入 Cytoscape 3.7.2软件，得到虫草素-抗癌靶点网络(图2)。

图1 虫草素-抗癌靶点韦恩图

菱形表示虫草素，圆形表示抗癌靶点图2 虫草素-抗癌靶点网络

2.2抗癌靶点的PPI网络如图3所示，每个参与互作的靶点用一个圆形表示，圆形面积越大表示其Degree越大，圆形的边框越粗表示其Betweenness越大。PPI网络中共有31个节点，154条相互作用连线，平均Degree为9.94，平均Betweenness为3.26×10-2，平均Closeness为5.45×10-2，Degree、Betweenness、Closeness同时在平均值之上的靶点有6个(表1)，说明它们处于PPI网络中的关键位置，可能是虫草素发挥抗癌作用的主要靶点。分析6个主要靶点，可分为调控细胞凋亡的TP53、CASP3、BCL2L1、XIAP，调控细胞增殖的AKT1，调控细胞周期的CDKN1A。

表1 主要靶点及其拓扑参数

图3 靶点PPI网络

2.3抗癌靶点的GO功能及富集分析运用OmicShare云平台的动态GO富集分析，筛选出P<0.001的GO条目322个，其中生物过程(biology process)276个，分子功能(molecular function)22个，细胞组成(cellular componet)24个。如图4所示，生物过程主要包括刺激反应、生物过程调节与控制、细胞代谢过程、信号传导等；分子功能包括结合、催化、调节等；细胞组成包括细胞器、蛋白质复合物、细胞膜等。进一步富集GO条目，发现其主要聚集在细胞凋亡、线粒体膜电位调节、氮化合物代谢过程正调控等方面(图5)，说明虫草素的抗癌作用主要与这些生物过程有关。

图4 虫草素抗癌靶点的GO功能分析

图5 虫草素抗癌靶点的GO功能富集

2.4抗癌靶点的KEGG通路分析依据P<0.05筛得虫草素抗癌靶点KEGG通路20条(表2)，图6为各通路富集气泡图，靶点比率(GeneRatio)是虫草素富集在通路下的靶点与该通路所有蛋白的比值，比值越大表明富集程度越高。颜色表示P值，越红表示P值越小，富集越显著。点的大小表示该通路富集靶点的个数，点越大表示富集的个数越多。由图可知，靶点比率较大的通路包括铂耐药、细胞凋亡、p53等，其中铂耐药通路富集的靶点最多，靶点比率最高，且P值最小。由图7的铂耐药通路图可见，虫草素激活p53，调节Bcl-2/Bax比例，作用于Caspase家族的CASP9、CASP8、CASP3，以及AKT和p21，促进癌细胞凋亡。

表2 KEGG信号通路信息

图6 虫草素抗癌靶点的通路富集气泡图

注：红色标记代表虫草素富集在铂耐药通路的靶点图7 铂耐药通路

2.5虫草素与抗癌主要靶点的分子对接由表3可知，6个靶蛋白与虫草素亲和力均<-5 kcal/mol，其中半胱氨酸蛋白酶-3(图8)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1(图9)及RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(图10)的亲和力最高，分别为-9.1、-7.1、-7.0 kcal/mol，它们与虫草素对接的氨基酸残基如表4所示。

表3 虫草素与6个主要靶点的分子对接

表4 靶点与虫草素对接的氨基酸残基

图8 半胱氨酸蛋白酶-3的分子对接模型

图9 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1的分子对接模型

图10 RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的分子对接模型

3 讨论

生物碱是存在于植物、真菌、细菌等有机体内的一类碱性含氮化合物，具有生物学活性[7]。以往发现的紫杉醇、喜树碱、长春碱等抗癌明星药都属于生物碱，大多数生物碱能够抑制癌细胞有丝分裂、阻滞细胞周期及增殖、诱导细胞凋亡和自噬等，是最具潜力的抗癌药物发掘地[8-10]。虫草素在化学结构上与腺苷相似，它可以取代腺苷参与癌细胞的代谢过程，抑制癌细胞的生长和繁殖，以虫草素为主要活性成分的新药已在白血病的临床中试用[11]。

本研究检索多个化合物靶点数据库、疾病靶点数据库，挖掘出31个虫草素抗癌靶点。通过靶点的蛋白互作分析，发现了6个主要靶点，分别为调控癌细胞凋亡的TP53、CASP3、BCL2L1、XIAP，调控细胞增殖的AKT1，以及调控细胞周期的CDKN1A，说明虫草素主要通过调控癌细胞凋亡、增殖及周期运行来发挥抗癌作用。将6个主要靶点与虫草素进行分子对接，结果亲和力均<-5kcal/mol，说明它们易结合，可能是虫草素作用的关键靶点。Ying等[12]研究表明虫草素通过提高胶质瘤C6细胞中p53及磷酸化p53水平诱导C6细胞凋亡。郑庆委等[13]研究发现虫草素可诱导促凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而抑制人舌癌TCA-8113细胞增殖而促进细胞凋亡。Xu等[14]研究发现虫草素通过激活Caspase级联凋亡信号，调节Bcl-2家族成员，诱导食管癌细胞ECA-109染色质浓缩，显著增加凋亡细胞数量。研究还发现虫草素分别下调人宫颈癌Hela细胞[15]和人骨肉瘤MG63细胞[16]中凋亡抑制蛋白Bcl-2，并上调促凋亡蛋白Bax表达，阻碍细胞周期进展，增进细胞早期凋亡。刘雯思等[17]研究发现虫草素对人肾癌细胞ACHN有显著的抑制作用，诱导人肾癌细胞ACHN凋亡，其可能的机制是抑制AKT蛋白的磷酸化，从而抑制AKT通路活化。Lee等[18]通过研究发现虫草素能够降低乳腺癌细胞MCF-7的XIAP表达，诱导细胞凋亡。

目前，超过50%的化疗方案涉及铂类药物的使用，其中FDA批准的顺铂、卡铂和奥沙利铂是癌症临床化疗方案中的支柱药物，它们主要通过与癌细胞DNA的相互作用引起癌细胞凋亡[19]。虽然铂类药物能够治疗多种癌症，但对铂类药物耐药已成为癌症化疗失败的主要原因[20]。铂类药物耐药机制有多种，包括癌细胞内药物蓄积减少、铂类药物失活、DNA的自我修复、抑制细胞凋亡等；其中抑制细胞凋亡与抑癌蛋白p53、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、XIAP表达密切相关[21]。KEGG通路分析发现虫草素富集最显著的信号通路是铂耐药，在此通路中虫草素激活p53，调节Bcl-2/Bax比例，作用于Caspase家族的CASP9、CASP8、CASP3，以及AKT和p21，促进癌细胞凋亡而逆转其铂耐药。罗俊等[22]研究证实与顺铂单独用药相比，联合虫草素后食管癌细胞ECA-109的抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著降低，而促凋亡蛋白Bax则显著增高，顺铂对ECA-109细胞的凋亡诱导效应明显增强。张超等[23]也发现虫草素能够调节Bax和Bcl-2的表达，增强肺癌细胞A549对顺铂的敏感性。Chen等[24]发现顺铂和虫草素联合给药后，人口腔癌OC3细胞的凋亡明显增强。