基于网络药理学探讨黄连治疗动脉粥样硬化的作用机制

吴 琼，吴雍真，李 倩，杜海洋，俞 琦

贵州中医药大学(贵州 贵阳 550025)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是以血管内皮细胞功能障碍、巨噬细胞激活、平滑肌增殖和迁移等过程为主要发展的一种血管壁慢性炎症性疾病，也是导致各类心脑血管疾病发生的病理基础，其主要病因是脂质代谢功能紊乱和免疫功能失调[1-2]。现已成为对人类健康产生巨大威胁的常见慢性疾病之一[3]。而中药多途径、多靶点的作用在有效改善AS相关症状及预后方面受到广泛关注[4]。中医认为AS的主要病因是热毒，因而清热解毒则是治疗AS等疾病的主要中医治法。中药黄连(Coptischinensis)归心、肝、胃、大肠经，为毛茛科植物黄连、三角叶黄连或云南黄连的干燥根茎，其性寒、味苦，具有泻火解毒、清热燥湿的功效。现代药理作用研究显示[5-6]，黄连及其主要活性成分具有调节血脂、降低血压、免疫调节、改善糖代谢等作用。课题组前期研究也发现，以黄连为君药的黄连解毒汤发挥抗AS作用可通过调控NLRP3炎症小体的表达，降低小鼠AS模型炎症因子水平[7]。网络药理学可通过构建“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网络，寻找发挥关键作用的有效成分与靶点。因此，本文拟通过网络药理学的研究方法，对黄连活性成分、靶蛋白及其与AS共同作用所涉及的信号通路、基因功能进行分析，为进一步研究传统中药黄连对AS的具体机制提供依据。

1 方法

1.1筛选黄连有效活性成分与OP靶蛋白通过TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库以口服生物利用度(OB)≥30，药物相似度(DL)≥0.18为标准，筛选黄连有效活性成分；查询有效活性成分相对应的靶点。在DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)获取AS相关靶点。所得化合物的靶点与AS靶点取交集，使用Cytoscape V3.7.2软件构建药物-活性成分-靶蛋白-疾病可视化联系。

1.2蛋白互作网络(PPI)构建交集靶点导入String数据库(https://string-db.org/)，选定“Homo sapiens”，构建蛋白质-蛋白质PPI网络。根据Degree值筛选出前20为核心靶点。

1.3生物学功能和通路分析利用DAVID数据库对1.2核心靶点进行基因本体(GO)功能和基因组百科全书(KEGG)通路分析，并设定物种为“Homo sapiens”、P<0.01。其中GO分析包括生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)。

2 结果

2.1黄连有效成分及靶蛋白分析通过TCMSP数据库检索关键词“黄连”并通过相关条件筛选得到黄连有效成分14个，并查询获得有效活性成分相对应的靶点，结果显示11个活性成分共对应128个靶点。在DisGeNET、GeneCards数据库检索关键词“Atherosclerosis”，筛选得到相应靶点后取并集，删除重复项后获得AS相关靶点。将筛选获得的有效活性成分对应的靶点与AS相关靶点取交集，获得62个靶点分别对应10个活性成分。利用Cytoscape软件建立“药物-活性成分-靶蛋白-疾病”网络(见图 1)。Degree排前3的有效活性成分为槲皮素、巴马汀、小檗碱，推测可能为黄连治疗AS的关键有效成分，见表1。

图1 黄连治疗AS的“药物-成分-靶点-疾病”网络

表1 黄连治疗AS关键有效成分

2.2构建蛋白PPI网络将重合的62个靶点导入String作PPI网络，网络共有62个节点，483条边，见图2，根据Degree大小排列，取前20筛选为核心靶点，见图3。

图2 黄连治疗AS靶点PPI网络

图3 Degree前20靶蛋白

2.3 GO功能与KEGG分析通过DAVID数据库对黄连治疗AS的20个潜在作用的核心靶点进行分析，根据P<0.01，共得到108个GO注释，40条KEGG通路。按P值大小，筛选出前20个GO注释，见图4，表中GO注释11个与BP有关，9个与MF有关，GO注释大多与BP和MF相关，如酶结合、RNA聚合酶Ⅱ对转录的正调控作用、转录因子结合、对药物的反应等。KEGG结果显示，20个核心靶点共富集在40条通路上，主要集中在癌症信号通路、乙型肝炎、低氧诱导因子(HIF-1)信号通路、病毒性心肌炎、肿瘤坏死因子(TNF-α)信号通路、军团菌病、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路、甲状腺激素信号通路、人嗜T淋巴细胞病毒I型感染、P53信号通路等。P值排前20条通路，见图5。

图4 黄连治疗AS的GO功能柱状图

图5 黄连治疗AS的KEGG通路气泡

3 讨论

AS是一种在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，常见且重要的动脉硬化血管病，主要病理基础是冠心病、脑血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心脑血管病[8]。据统计，全球每年死于AS性疾患者约有2000万，严重危害人类生命健康[9]。目前因对AS的发病机制尚未完全清楚，故导致临床上有效防治药物缺乏[10]。因此，寻找疗效显著且副作用小的药物成为亟待解决的问题，传统中药多途径、多靶点的作用也受到学者广泛关注。本文通过网络药理学构建黄连治疗AS靶蛋白PPI网络、黄连活性成分-AS靶点网络等，分析黄连防治和治疗AS的可能作用机制。研究发现[11]槲皮素可有效改善动脉粥样硬化，不仅通过影响脂质代谢、胶原等成分的合成与分泌，还可通过干预PI3K/Akt/NF-κb通路中关键蛋白的活性，抑制平滑肌细胞、主动脉壁成纤维细胞增殖，从而延缓动脉硬化进程；巴马汀在一定程度上可降低血清低密度脂蛋白(LDL-C)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)，起到抑制AS作用[12]；小檗碱作为黄连的主要活性成分，具有降血糖血脂、抗充血性心力衰竭、抗血小板聚集，减轻缺血再灌注损伤，保护心肌抑制血管平滑肌细胞增殖、保护血管内皮细胞和促血管内皮舒张因子释放等多种作用，可从多个环节抑制AS的形成与发展[13-15]。

PPI网络分析结果显示，黄连治疗AS与白介素-6(IL-6)、表皮生长因子受体(EGFR)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP)3等20个靶点关系密切。IL-6为炎症反应的重要调节因子，IL-6广泛表达于脂纹中泡沫细胞，并在纤维帽及粥样斑块肩部高表达，其还可作用于下丘脑与肝脏，引起C反应蛋白、纤维蛋白原及血清淀粉样蛋白的产生，促进AS[16]。EGFR广泛存在于哺乳类动物细胞表面，与配体表皮生长因子或转化生长因子结合，传递信号，影响细胞的生长与分化。EGFR的活性对心脏正常发育至关重要，在心血管疾病中具有重要作用，EGFR的激活与AS、血压调节等具有密切联系[17]。VEGFA是VEGF家族中最重要的成员之一，被认为是传统意义上的VEGF。研究显示，VEGF在粥样斑块形成处表达明显增高，并且经其受体的介导对单核/巨噬细胞的趋化作用，使其在斑块部位进一步聚集，促进炎症病变发展[18]。CASP3是caspase家族中在细胞凋亡过程发挥重要功能的凋亡执行者，位于caspase级联反应的最下游。晚期AS中斑块的变化多由巨噬细胞和血管平滑肌细胞的凋亡而导致，而CASP3是细胞凋亡途径中的关键执行蛋白，已在人和小鼠AS斑块中发现，但其在AS形成中的作用机制尚未明确[19]。

GO功能富集分析结果提示黄连治疗AS可能是通过调控酶结合、RNA聚合酶Ⅱ对转录的正调控作用、转录因子结合、对药物的反应等基因功能有关。KEGG通路富集分析，发现靶点主要富集在癌症信号通路、PI3K/Akt信号通路、TNF-α信号通路、乙型肝炎、低氧诱导因子(HIF-1)信号通路、病毒性心肌炎、P53信号通路、甲状腺激素信号通路、人嗜T淋巴细胞病毒I型感染、军团菌病等通路上。KEGG结果中显著性最高的癌症信号通路较为复杂，具有多个下游通路，如：丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、VGEF信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路等。MAPK信号通路具有调节细胞生长、分化、增殖及凋亡等重要生物学作用，并且其信号通路转导级联反应在AS发病过程中起重要调控作用。不同的细胞外刺激信号可通过MAPK信号通路的多条并行通路调节AS斑块内各个炎症反应及死亡过程[20]。PPAR的功能与心脑血管疾病的发生和发展关系密切，是核受体超家族的重要成员，其中以PPARγ研究最为广泛。相关研究[21]显示PPARγ基因多态性与冠心病存在一定关系。PI3K/Akt信号通路对细胞的各项功能均起到非常重要的调节作用，是连接细胞外信号与细胞功能效应的重要分子。研究发现[22-23]，PI3K信号通路参与AS、高血压、心衰等心血管疾病的病理生理过程，且PI3K抑制剂可有效抑制AS、稳定动脉粥样斑块、保护心肌收缩力及降低血压等。

综上所述，中药黄连治疗AS的关键有效成分为槲皮素、巴马汀、小檗碱，可能通过调节IL-6、EGFR、CASP3、VEGFA等靶点及癌症信号通路、PI3K/Akt信号通路等达到防治AS的作用。