齐墩果酸衍生物的合成及其与MEK靶点分子对接研究

张蓬勃， 宋艳玲

(沈阳化工大学 制药与生物工程学院， 辽宁 沈阳 110142)

齐墩果酸(oleanolic acid，OA，图1)是一种五环三萜类化合物，具有显著的抗肿瘤、抗炎、抗氧化和抗血小板聚集等药理活性[1-2].但齐墩果酸的水溶性非常差，生物利用度低，大剂量服用会造成胆囊水肿，限制了其临床应用[3].含氮化合物广泛存在于自然界，许多有机含氮化合物具有显著的生物活性.文献报道三萜类化合物中引入氮原子能增加化合物的抗肿瘤活性，且含氮化合物与酸易生成盐，溶解性明显增加[4].席夫碱活性片段具有特殊的生理活性，多种含席夫碱的化合物具有抗肿瘤、抗菌和抑菌等药用活性[5-6].本文通过将席夫碱活性片段引入至OA-3位，设计并合成化合物Ⅰ1～Ⅰ4，通过席夫碱还原进一步设计并合成化合物Ⅱ1～Ⅱ4，以期提高目标化合物的生物活性和生物利用度.

近年来计算机辅助药物设计(computer aided drug design，CADD)在新药研发过程中发挥着重要作用.分子对接研究是将配体分子放置于受体分子的活性位点，利用化合物与受体蛋白的三维结构进行对接，预测化合物的生物活性.ERK(extracellular regulated kinase)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的重要成员，其信号转导通路(Ras-Raf-MEK-ERK)调控异常会导致多种癌细胞增生、扩散并转移[7].MEK作为ERK途径中的重要靶点，已成为抗肿瘤药物的研究热点.本文通过计算机辅助设计的方法研究OA衍生物与MEK分子对接，预测目标化合物抑制MEK的活性.

图1 齐墩果酸的立体化学结构

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Bruker ARX-600型核磁共振仪，美国Bruker公司；Büchi B-540熔点测定仪，瑞士Büchi公司；薄层色谱(GF-254)，柱色谱硅胶(200～300目)，青岛海洋化工有限公司；齐墩果酸(质量分数为98 %)，陕西慈缘生物技术有限公司；芳香醛类药品，国药集团化学试剂有限公司.其他溶剂和药品均为分析纯.

1.2 合成实验

OA衍生物的合成路线见图2.

试剂和反应条件:(a) K2CO3，CH3I，DMF，室温；(b) 琼斯试剂，丙酮，异丙醇，0 ℃；(c) NH2OH·HCl，Py，50 ℃；(d) NaBH3CN，TiCl3，CH3COONH4，CH3OH，室温；(e) 芳香醛，乙醇，80 ℃；(f) NaBH3CN，乙酸，室温

1.2.1 齐墩果酸甲酯(1)的制备

将OA(5.00 g，10.94 mmol)和无水K2CO3(3.78 g，27.35 mmol)溶于50 mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌下缓慢加入碘甲烷(1.37 mL，21.89 mmol)，室温下继续搅拌反应6 h，TLC监测反应.反应结束后加水稀释，乙酸乙酯萃取，饱和NaCl溶液洗涤，水洗，合并有机相.无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸干溶剂，得白色固体.干燥过夜，甲醇重结晶得白色针状晶体化合物14.40 g，产率85 %，m.p.196～198.8 ℃(文献m.p.197～198.2 ℃)[8].

1.2.2 3-羰基-齐墩果酸甲酯(2)的制备

将齐墩果酸甲酯(1)(4.40 g，9.35 mmol)溶于100 mL丙酮中，冰浴下缓慢滴加Jones试剂(11.5 mL)，直至反应液橘红色不再消失，滴毕，室温下反应1～2 h，TLC监测反应.反应完毕，加入130 mL异丙醇淬灭.反应结束后，减压蒸除部分溶剂，乙酸乙酯萃取，饱和NaCl溶液洗涤，水洗，合并有机相.无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸干，得淡黄绿色固体.干燥，甲醇重结晶得白色晶体化合物24.15 g，产率95 %，m.p.186～187 ℃(文献m.p.185～186 ℃)[9].

1.2.3 3-羟肟基-齐墩果酸甲酯(3)的制备

将3-羰基-齐墩果酸甲酯(2)(4.15 g，8.87 mmol)溶于50 mL吡啶中，加入盐酸羟胺(2.76 g，39.74 mmol)，50 ℃下反应2 h，TLC监测反应.反应结束后加入适量二氯甲烷稀释，用质量分数为10 %的盐酸洗涤3次，饱和NaCl溶液洗涤，水洗，合并有机相.无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸干，得白色固体化合物33.24 g，产率75.5 %，m.p.244～246 ℃(文献m.p.247～249 ℃)[9].

1.2.4 3-氨基-齐墩果酸甲酯(4)的制备

将3-羟肟基-齐墩果酸甲酯(3)(4.88 g，10.10 mmol)溶于100 mL甲醇中，加入乙酸铵(9.04 g，117.30 mmol)，再加入NaBH3CN(7.08 g，112.70 mmol)，充分搅拌溶解，冰浴下缓慢滴加质量分数为15 %的三氯化钛溶液(29.33 mL，34.22 mmol)，室温下反应12 h，TLC监测反应.反应结束后，蒸除部分溶剂，用2 mol/L的NaOH溶液调pH至10，二氯甲烷萃取，蒸馏水洗涤，合并有机相.无水硫酸钠干燥，抽滤，减压蒸干，硅胶柱层析分离(200～300目)，洗脱剂为甲醇/二氯甲烷，得白色固体化合物43.78 g，产率80 %，m.p.221.3～223.7 ℃.ESI-MS，m/z:470.8[M+H]+；1H-NMR(600MHz，CDCl3)，δ:5.29(1H，s，H-12)，3.64(3H，s，28-COOCH3)，2.87(1H，d，J=13.6 Hz，H-18)，2.51(1H，d，J=9.7 Hz，H-2)，1.14(3H，s，CH3)，1.02(3H，s，CH3)，0.94(3H，s，CH3)，0.91(6H，s，2CH3)，0.81(3H，s，CH3)，0.74(3H，s，CH3).

1.2.5 化合物Ⅰ1～Ⅰ4的制备

1.2.5.1 化合物Ⅰ1的制备

将3-氨基-齐墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)溶于10 mL无水乙醇中，苯甲醛(0.041 g，0.384 mmol)溶于5 mL无水乙醇中，随后将芳香醛乙醇溶液逐滴加入反应体系中，80 ℃条件下回流反应4～6 h.溶液变浑浊，有固体析出，抽滤，甲醇重结晶得白色固体产物化合物Ⅰ10.12 g，m.p.192～194 ℃，产率63 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ:8.26(s，1H)，7.74～7.72(m，2H)，7.41～7.37(m，3H)，5.31(s，1H)，3.63(s，3H)，1.16(s，3H)，1.01(s，3H)，0.98(s，3H)，0.93(s，3H)，0.90(s，3H)，0.78(s，3H)，0.76(s，3H).

1.2.5.2 化合物Ⅰ2的制备

实验步骤同化合物Ⅰ1.3-氨基-齐墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)与邻硝基苯甲醛(0.058 g，0.384 mmol)反应，得到棕色固体产物化合物Ⅰ20.118 g，m.p.193～196 ℃，产率57 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ：8.66(s，1H)，8.01～7.98(m，2H)，7.64(d，J=7.6 Hz，1H)，7.53(t，J=8.0 Hz，1H)，5.31(s，1H)，3.63(s，3H)，1.16(s，3H)，1.01(s，3H)，0.98(s，3H)，0.93(s，3H)，0.91(s，3H)，0.82(s，3H)，0.76(s，3H).

1.2.5.3 化合物Ⅰ3的制备

实验步骤同化合物Ⅰ1.3-氨基-齐墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)与3，4-二氯苯甲醛(0.068 g，0.384 mmol)反应，得到白色固体产物化合物Ⅰ30.116 g，m.p.192～195 ℃，产率53 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ：8.17(s，1H)，7.83(d，J=1.9 Hz，1H)，7.54～7.52(m，1H)，7.46(d，J=8.3 Hz，1H)，5.31(s，1H)，3.63(s，3H)，1.16(s，3H)，1.00(s，3H)，0.96(s，3H)，0.93(s，3H)，0.90(s，3H)，0.76(s，6H).

1.2.5.4 化合物Ⅰ4的制备

实验步骤同化合物Ⅰ1.3-氨基-齐墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)与3，5-二氯水杨醛(0.074 g，0.384 mmol)反应，得到黄色固体产物化合物Ⅰ40.161 g，m.p.195～196 ℃，产率72 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ：15.04(s，1H)，8.18(s，1H)，7.41(d，J=2.5 Hz，1H)，7.13(d，J=2.6 Hz，1H)，5.30(s，1H)，1.15(s，3H)，0.98(s，3H)，0.96(s，3H)，0.93(s，3H)，0.90(s，3H)，0.85(s，3H)，0.75(s，3H).

1.2.6 化合物Ⅱ1～Ⅱ4的制备

1.2.6.1 化合物Ⅱ1的制备

将3-氨基-齐墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)溶于10 mL无水乙醇中，将苯甲醛(0.041 g，0.384 mmol)用5 mL无水乙醇溶解后逐滴加到反应瓶中，80 ℃条件下回流反应4～6 h，冷却至室温后，加入NaBH3CN(0.06 g，0.96 mmol)，室温条件下反应2 h，TLC监测反应.反应结束后加入5 mL冰醋酸进行淬灭，二氯甲烷萃取，饱和NaCl溶液洗涤3次，合并有机相.无水硫酸钠干燥，抽滤，减压悬蒸，硅胶柱层析分离(200～300目)，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯，得到白色固体产物化合物Ⅱ10.08 g，m.p.187～190 ℃，产率42 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ：7.35(d，J=7.1 Hz，2H)，7.31(t，J=7.6 Hz，2H)，7.25～7.21(m，2H)，5.28(s，2H)，3.95(d，J=13.2 Hz，1H)，3.67(d，J=13.2 Hz，1H)，3.62(s，3H)，1.11(s，3H)，0.97(s，3H)，0.92(s，3H)，0.90(s，6H)，0.74(s，3H)，0.72(s，3H).

1.2.6.2 化合物Ⅱ2的制备

实验步骤同化合物Ⅱ1.3-氨基-齐墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)与邻硝基苯甲醛(0.058 g，0.384 mmol)反应，得到棕色固体产物化合物Ⅱ20.083g，m.p.182～186 ℃，产率40 %.1H-NMR(600 MHz，CDCl3)，δ：7.89(d，J=8.1 Hz，1H)，7.66(d，J=7.7 Hz，1H)，7.55(t，J=7.5 Hz，1H)，7.38(t，J=7.7 Hz，1H)，5.28(s，1H)，4.20(d，J=14.3 Hz，1H)，3.91(d，J=14.3 Hz，1H)，3.62(s，3H)，1.12(s，3H)，0.94(s，3H)，0.93(s，3H)，0.90(d，J=2.2 Hz，6H)，0.74(s，3H)，0.72(s，3H).

1.2.6.3 化合物Ⅱ3的制备

实验步骤同化合物Ⅱ1.3-氨基-齐墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)与3，4-二氯苯甲醛(0.068 g，0.384 mmol)反应，得到白色固体产物化合物Ⅱ30.076 g，m.p.185～186 ℃，产率35 %.1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)，δ：7.61(s，1H)，7.54(d，J=8.2 Hz，1H)，7.34(d，J=8.2 Hz，1H)，5.18(s，1H)，3.84(d，J=14.3 Hz，1H)，3.61(d，J=14.5 Hz，1H)，3.54(s，3H)，1.07(s，3H)，0.91(s，3H)，0.87(d，J=2.7 Hz，6H)，0.85(s，3H)，0.69(s，3H)，0.65(s，3H).

1.2.6.4 化合物Ⅱ4的制备

实验步骤同化合物Ⅱ1.3-氨基-齐墩果酸甲酯(0.15 g，0.32 mmol)与3，5-二氯水杨醛(0.074g，0.384 mmol)反应，得到黄色固体产物化合物Ⅱ40.10g，m.p.182～184 ℃，产率45 %.1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)，δ：13.11(s，1H)，7.29(d，J=2.6 Hz，1H)，7.08(d，J=2.6 Hz，1H)，5.19(s，1H)，4.07(d，J=14.7 Hz，1H)，3.85(d，J=14.6 Hz，1H)，1.09(s，3H)，0.99(s，3H)，0.88(d，J=2.5 Hz，6H)，0.86(s，3H)，0.73(s，3H)，0.66(s，3H).

1.3 化合物与MEK的分子模拟对接

从蛋白数据库(protein data bank，PDB)(http://www.rcsb.org/)中下载MEK靶蛋白结构(PDB编号：4MX5).在ChemDraw中以structure选项下的convert name to structure功能分别画出其结构图，并以MDL Molfile(*.mol)格式存储，使用Discovery studio 4.0软件导入上步建立的MDL Molfile(*.mol)格式文件，使用其convert功能，将MDL Molfile格式转换成为sdf-MDL MOL format(*.mol2)格式文件.利用计算机辅助药物设计软件Molegro Virtual Docker(MVD 6.0)对各分子对接的结合能进行测试，用Discovery studio 4.0分析对接模式.

2 结果与讨论

MVD软件能够通过函数打分的形式，预测并计算蛋白质与小分子配体的相互作用，结果以结合自由能(Escore=Einter+Eintra，kJ/mol)形式表达，Einter表示配体-蛋白质相互作用能量，Eintra表示配体内部能量.结合能绝对值越大，表示结合亲和力越强.分子对接的结合能结果见表1.

研究结果表明：化合物Ⅰ1～Ⅰ4和Ⅱ1～Ⅱ4与MEK靶蛋白(PDB编号：4MX5)的结合能均高于OA，且Ⅱ系列高于Ⅰ系列，表明席夫碱还原后的化合物与靶蛋白具有更高的结合能，其中化合物Ⅱ4的结合能高达-552.36 kJ/mol，超过MEK靶蛋白抑制剂曲美替尼的结合能-538.63 kJ/mol.曲美替尼是一种代表性的小分子MEK抑制剂[10]，现通过分子模拟对接方法研究其与MEK靶蛋白(PDB编号：4MX5)的相互作用(图3).分子对接结果表明：曲美替尼可以和MEK蛋白氨基酸残基形成多个牢固的氢键，与靶蛋白产生较大结合力.化合物Ⅱ4与靶蛋白的分子模拟对接结果表明：Ⅱ4能较好地插入到靶点的活性口袋中，其结构中的酯基、芳香羟基通过氢键与靶蛋白氨基酸残基(SER：176，GLU：177，ARG：258，VAL：81)紧密结合；还原席夫碱亚甲基片段、芳香取代基团通过碳氢键、疏水键、π—σ 键和π—alkyl键等与靶蛋白多个氨基酸残基(CLU：177，SER：176，ARG：213，TYR：123，ILE：172)结合，如图4所示.

图4 化合物Ⅱ4与MEK靶蛋白(PDB编号：4MX5)分子对接模式

3 结 论

设计并合成了8个未见文献报道的OA衍生物，通过分子对接的方法模拟目标化合物和MEK靶蛋白大分子相互作用.研究结果表明:化合物Ⅱ4可通过氢键与MEK靶蛋白多个氨基酸残基(SER：176，GLU：177，ARG：258，VAL：81)结合，产生较高的结合能.可通过药理活性实验进一步研究其抑制MEK的活性.计算机辅助筛选方法可大大提高新药研发的速度，降低新药研发的成本，同时分子模拟对接模式的研究对药物作用机制研究具有重要意义.