米诺环素对缺血性脑卒中血脑屏障重塑的影响及其机制*

李蕊蕊, 林园凯, 张格, 李姣, 黄薇园△

海南省人民医院(海南医学院附属海南医院) 1放射科， 2病理科(海南海口 570311)

血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)是脑微血管特有的屏障结构。微血管内皮细胞及微血管内皮细胞之间的紧密连接是形成屏障作用的最主要结构基础。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)家族通过降解细胞外基质及基底膜成分，在脑缺血微血管损伤中扮演着重要角色。脑缺血再灌注促进了MMP-9活性增强，破坏了神经血管基质，从而破坏了BBB的完整性，诱发了不可逆的神经细胞凋亡，并与血管源性脑水肿以及出血性转化等预后不良因素密切相关[1-2]。拮抗MMP可减轻BBB破坏，减轻缺血再灌注损伤及出血性转换的发生，减少梗死体积，保证功能血管恢复血流灌注，促发以BBB重塑及血管再生为基础的神经及轴突再生，最终改善缺血性脑卒中预后[2-3]。米诺环素(minocycline，MC)是一种能通过BBB的四环素类抗生素，在急性脑缺血的动物模型中具有广谱的抗炎、抗凋亡、抗氧化及血管保护作用[4-5]。MC通过MMP及小胶质细胞/巨噬细胞促发脑缺血再灌注后的BBB重塑。然而最新研究显示MMP作用机制较为复杂，MMP在缺血性脑卒中中具有双重功效，即早期破坏了紧密连接，引起BBB破坏，而恢复期却促发了BBB重塑及新生血管再生[6]，具体的机制还未完全阐明，并且既往研究MC神经保护机制的方法均为病理学方法，运用影像学方法无创性动态监测脑卒中后内源性重塑过程及疗效的研究还未见报道。为了深入探讨MC对缺血性脑卒中BBB重塑作用机制及影像可视化。2018年5月至2019年3月，本研究拟建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，并联合运用磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)成像技术，观察不同给药时相MC在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验选取SPF级雄性SD大鼠48只，体重(265±15)g，购于上海西普普克实验动物有限公司。

1.2 动物短暂性大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型 实验动物随机分为4组(早期给药组、晚期给药组、生理盐水组及假手术组)，每组12只。其中早期给药组于手术后即刻尾静脉注入MC(3 mg/kg)；晚期给药组于拔线后恢复再灌注后6 h后大鼠尾静脉注入MC(3 mg/kg)；生理盐水组于再灌注即刻注入相同体积的生理盐水；假手术组除了不插入线栓外，其余处理同生理盐水组。大鼠在手术前禁食8 h，自由饮水。350 mg/kg的水合氯醛腹腔注射麻醉，颈部正中切口，钝性分离皮肤和皮下组织等结构，暴露出右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈外动脉(external carotid artery， ECA)以及颈内动脉(internal carotid artery，ICA)。ICA暂时血管夹夹闭，于CCA的近端打一个活结，在ECA的远端插入0.22 mm线栓，打开ICA的血管夹，线栓进深距CCA分叉处约18～20 mm稍有阻力感时则停止。结扎线栓及血管，松开CCA活结，此时开始记录缺血的时间。阻断血流2 h后，拔出线栓使大脑中动脉恢复血流再灌注，随后缝合手术切口。大鼠麻醉清醒后出现对侧肢体偏瘫及MRI-DWI序列显示右侧大脑半球高信号梗死灶，即表示模型制备成功。假手术组仅仅分离CCA、ICA、ECA，不插入线栓。

1.3 神经功能缺损评分 缺血再灌流24 h后，依据Longa等[7]的方法对假手术组、生理盐水组和药物干预组分别进行神经功能缺损评分。评分标准为：0分，没有任何神经功能缺损征象；1分，左侧前肢出现向内收；2分，行走时向瘫痪一侧转圈；3分，行走时向瘫痪一侧倾倒；4分，不可自行走动、意识障碍或死亡。1～3分者视为模型制造成功，0分者、4分者、表现有癫痫发作者以及取脑组织的时候发现有脑出血者都给予排除并且随机补充。

1.4 大鼠脑组织苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色 每组选取3只行染色。实验结束后水合氯醛麻醉动物，断头处死，迅速选取缺血侧视交叉附近约1 mm厚度冠状切片脑组织，10%甲醛溶液固定，按照常规HE实验步骤进行染色。

1.5 免疫组化染色 每组选取3只行免疫组化。免疫组化指标包括：IL-1β、TNF-α、IL-10、YM1、RECA-1、PDGFR-β、CD11b，染色步骤按照说明书进行。将组织在4%多聚甲醛中4℃保存24 h以上，切片(5 μm厚)脱蜡后进行免疫组织化学染色。然后用二甲苯洗涤玻片，在不同浓度的乙醇中水合。收集切片，置于3% H2O2中，室温甲醇中放置15 min，然后浸泡在柠檬酸缓冲液(0.01 mol/L，pH=6.0)中95℃下20 min，用PBS洗涤玻片多次，在1%牛血清中预孵育。初级抗体在室温下孵育45 min，然后在4℃下孵育过夜。切片用聚合物增强剂孵育20 min，用酶标记的抗兔/小鼠聚合物再活化30 min。用3，4-二氨基联苯胺(Vector Laboratories Ltd， UK)处理玻片，在光学显微镜下进行观察。

1.6 血清中细胞因子的检测 采用商品化测定ELISA试剂盒测定血清中白细胞介素(IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量，按照试剂盒说明书操作。

1.7 Western blot法检测脑组织中相关蛋白的表达

1.7.1 脑组织中总蛋白的提取 每组选取3只行Western blot。取冻存的脑组织样本，称重，加入RIPA裂解液及PMSF，置碎冰上裂解组织30 min。收集裂解液，4℃ 12 000 r/min离心10 min。用移液器吸取上清液，按4∶1(上清液：5×SDS-PAGE Loading Buffer)的比例加入loading缓冲液。留取5 μL上清液与EP管中测OD值。装标记好的EP管装入密封袋，置于-80℃冰箱保存。

1.7.2 样品蛋白浓度测定(BCA法) 用BCA蛋白定量试剂盒对提取的蛋白进行定量，操作步骤按照试剂盒说明进行，酶标仪测定标准品以及样品吸光度，根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。

1.7.3 SDS-PAGE电泳 根据待测蛋白的分子量选择制备10%浓度的分离胶，胶凝固后，制备5%浓缩胶，灌入分离胶上端，插入上样梳。当浓缩胶完全聚合后(约30 min)，放入电泳槽中固定，加入适量的电泳缓冲液。按相同体积加入各蛋白样品及预染蛋白marker，使蛋白含量不低于20 μg/孔。样品在浓缩胶中泳动时电压为80 V，30～40 min后当溴酚蓝进入分离胶后，将电压增至120 V，继续电泳直到溴酚蓝接近分离胶底部。根据跑胶指标的kD值切相应位置的胶。PVDF膜以甲醇活化10 s，然后与滤纸一起浸入转移缓冲液中。按海绵-双层滤纸-胶-PVDF膜-双层滤纸-海绵的顺序组装凝胶转移夹层，放入转移槽中。加入转移缓冲液，接通电源，300 mA恒流电转移不同时间(根据转移蛋白分子量的大小来确定具体的转移时间)。

1.7.4 免疫印迹 杂交电转移完毕，取出PVDF膜，放入5%脱脂奶粉封闭液中，置摇床上室温封闭2 h。封闭过的膜放入杂交袋中，加入一抗4℃孵育过夜，使抗原抗体充分结合。隔天，将膜从杂交袋中取出，用TBST洗涤3次，10 min/次；再放入新杂交袋中，加入HRP标记的二抗以结合一抗，置摇床上室温孵育2 h后取出PVDF膜，用TBST洗涤3次，10 min/次。

1.7.5 Western blot结果检测 ECL化学发光法检测，将混合好的发光液滴加到膜上，用凝胶成像系统拍照成像。

1.8 免疫荧光法检测 Iba-1+小胶质瘤细胞数量每组选取3只行免疫荧光。免疫荧光标记法检测小胶质细胞活化。脑组织的石蜡切片置于58℃烤箱中，烤切片15～20 min左右，室温冷却。石蜡切片用二甲苯脱蜡(二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各浸泡15 min)，然后再分别置于梯度浓度乙醇中进行水化，浓度依次为100%、90%、75%、50%，各10 min，随后在双蒸水中浸泡5 min，再在中性磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡，并置于摇床上缓慢清洗3次，5 min/次。采用3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min，此过程注意避光。切片浸泡在1×EDTA-柠檬酸钠抗原修复液中，用微波中火加热6 min，在室温条件下冷却。使用10%山羊血清37℃下封闭30～60 min。滤纸吸去多余液体，加入Iba-1一抗混合稀释液，4℃过夜。PBS缓慢清洗3次，加入稀释好的二抗，室温避光孵育1 h，再用PBS洗3次。抗荧光衰减淬灭剂封片。

1.9 MRI扫描 每只模型于处死前行MRI扫描。采用德国Siemens 3.0 T 扫描仪(Verio，Siemens Medical Solutions，Erlangen，Germany)和专用动物线圈，大鼠头置线圈中央，扫描序列包括DWI及SWI。DWI 采用EPI 序列，TE/TR：83 ms/4 000 ms；FOV：94 mm×94 mm，b值分别为0、1 000 s/mm2。SWI，TE/TR：20 ms/28 ms；FOV：128 mm×128 mm；矩阵：256×256；翻转角：15°。各序列扫描层厚2 mm，间距0，层数均为9层。

DWI产生的ADC图用以显示梗死灶并测量梗死体积。SWI图像用以显示新生血管，SWI结果判读由两名有经验的影像诊断医生完成，梗死灶区域出现连续层面条状低信号影，判定为新生血管；不连续斑点状、片状低信号影判定为出血灶。

1.10 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件，各组间数据采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组的神经功能恢复情况及梗死体积 行为学实验结果显示，与假手术组比较，生理盐水组、早期给药组和晚期给药组出现明显的神经功能障碍，提示造模成功。与生理盐水组相比，早期给药组(P=0.008)显著改善手术引起的神经功能障碍，晚期给药组没有明显的改善现象(P=0.360)。DWI的ADC图显示除了假手术组，其余各组均显示明显低信号的梗死灶，证明手术成功诱导了大鼠脑梗死。与假手术组比较，生理盐水组、早期给药组和晚期给药组大鼠出现大面积梗死区域。与生理盐水组相比，早期给药组和晚期给药组的脑梗死面积明显低于生理盐水组(P<0.001)。见表1、图1。

表1 各组的神经功能恢复情况及梗死体积

注：A:假手术组；B:生理盐水组；C:早期给药组；D:晚期给药组

2.2 各组脑组织病理学的改变 HE染色结果显示：假手术组大鼠神经元，胶质细胞及毛细血管形态正常，核仁清晰可见，神经纤维密集，排列整齐；生理盐水组神经元结构变得疏松，排列紊乱，细胞外间隙呈网状增大，神经元肿胀，有程度不同的神经元变形，核固缩，细胞坏死等现象；MC组别明显减少缺血再灌注对大鼠脑组织损伤，细胞肿胀和间质水肿明显缓解。见图2。

注：A:假手术组；B:生理盐水组；C:早期给药组；D:晚期给药组

2.3 各组脑卒中后的血清炎症因子水平 与假手术组比较，生理盐水组大鼠血清 IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著性升高；与生理盐水组比较，给药组大鼠血清促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著性降低(P<0.05)。早期给药组较晚期给药组差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组脑卒中后血清炎症因子水平

2.4 各组脑卒中后免疫组织化学分析

2.4.1 促炎因子及抗炎因子 与假手术组比较，生理盐水组大鼠组织促炎因子IL-1β、TNF-α升高，抗炎因子IL-10、TGF-β、YM1降低；与生理盐水组比较，MC治疗组大鼠组织促炎因子IL-1β、TNF-α降低，抗炎因子IL-10、TGF-β、YM1升高，其中，早期给药组较晚期给药组改善炎症的作用更为明显。见图3。

图3 各组大鼠脑组织中促炎因子和抗炎因子的表达(免疫组化，×100)

2.4.2 新生血管及小胶质细胞标记物 与假手术组比较，生理盐水组大鼠组织标记血管新生的RECA-1和PDGFR-β强度变弱，表达明显减少，与生理盐水组比较，MC治疗组大鼠组织RECA-1和PDGFR-β表达明显上调，其中，早期给药组较晚期给药组促进血管新生的作用更为明显(图4)。SWI同样证实治疗组梗死灶内新生血管数量高于生理盐水组，早期给药组梗死灶内新生血管数量高于晚期给药组(图5)。

CD11b阳性细胞为棕黄色，脑缺血可诱导小胶质细胞从静息状态快速向活化状态转变。免疫组化结果显示生理盐水组CD11b标记的阳性细胞明显增多且形态大小不均一；MC治疗组CD11b染色强度变弱，数量减少；早期给药组较晚期给药组对CD11b的抑制作用更为明显(图4)。

2.5 各组脑卒中后相关蛋白表达

2.5.1 紧密连接蛋白 生理盐水组紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-5表达显著降低；与生理盐水组比较，MC治疗组紧密连接蛋白表达明显升高，其中早期给药组较晚期给药组ZO-1、occludin蛋白升高作用更为明显(图6)。

2.5.2 促炎因子 生理盐水组促炎因子IL-1β、TNF-α、MMP-3表达明显升高；与生理盐水组比较，MC治疗组促炎因子表达明显降低，其中早期给药组较晚期给药组炎症因子IL-1β、TNF-α降低更为明显(图6)。

2.5.3 抗炎因子 生理盐水组抗炎因子IL-10、TGF-β、YM1表达明显降低；与生理盐水组比较，MC治疗组抗炎因子表达明显升高，其中晚期给药组较早期给药组抗炎因子水平无明显差别(图6)。

图4 各组大鼠脑组织新生血管及小胶质细胞标记物的表达(免疫组化，×100)

注：A:假手术组；B:生理盐水组；C:早期给药组；D:晚期给药组

图6 各组脑卒中后紧密连接蛋白、炎症因子及抗炎因子的蛋白表达水平

2.6 脑卒中后Iba-1的表达 Iba-1特异性表达于小胶质细胞/巨噬细胞，并在缺血性脑卒中的脑组织中高表达，结果显示各组Iba-1荧光标记定量值差异有统计学意义(F=150.516，P<0.001)。生理盐水组Iba-1表达的强度(17.01±1.43)明显高于其余三组，假手术组(3.74±0.30)表达强度最低；MC给药组与生理盐水组相比，MC降低了Iba-1的表达，且早期给药组(8.58±0.30)较晚期给药组(9.81±0.41)对Iba-1表达的降低作用更明显，但两组比较差异无统计学意义(P=0.07)，其余各组两两比较Iba-1的表达水平均差异有统计学意义(P<0.001)。见图7。

注：A:假手术组；B:生理盐水组；C:早期给药组；D:晚期给药组

3 讨论

MC是第2代半合成四环素类抗生素，除了具有传统抗菌作用外，还具有抗炎、免疫调节等能力。动物及临床实验都证实MC对缺血性脑卒中后神经细胞损害具保护作用[8-9]，其神经保护作用机制及疗效成为国内外研究的热点。MC治疗后一方面显著降低了MMP-9的活性，减轻缺血再灌注损伤，促进缺血区神经元的存活及BBB重塑[10-11]。另一方面通过抑制小胶质细胞的聚集和激活发挥抗炎作用、直接清除氧自由基发挥抗氧化应激作用、调节半胱氨酸蛋白酶依赖或非依赖途径发挥抗凋亡作用[12]。但是不同给药时相的保护作用及机制还未完全阐明。我们于不同时相给药，联合病理及影像学方法观察MC对脑缺血再灌注后BBB重塑的作用。

DWI结果显示早期给药和晚期给药组的脑梗死体积明显低于生理盐水组。行为学实验结果显示早期给药显著改善手术引起的神经功能障碍，晚期给药组没有明显的改善现象。提示MC可以缓解大鼠的脑缺血并对脑卒中后神经功能恢复具有保护作用，早期给药优于晚期给药，HE染色从细胞学水平证实MC组别缺血脑组织的细胞肿胀和间质水肿明显缓解，提示MC可以减少缺血再灌注对大鼠脑组织的损伤。MC对MCAO引起的脑中卒有治疗作用，手术后给予大鼠MC能够有效减小梗死面积改善神经功能障碍；并且手术后立即给药对神经功能障碍的改善作用更明显。这与其他学者的研究结果相同[8，13]。

缺血再灌注诱导脑组织炎症发生，促进炎症因子的表达，激活小胶质细胞/巨噬细胞，释放蛋白水解酶。MC在短暂性脑卒中后对于炎症因子和抗炎因子的调节规律与前期研究相仿[14]。本研究组织学及血清学结果都显示，MC能够上调抗炎因子水平，下调炎症因子水平，抑制小胶质细胞/巨噬细胞的活化，降低蛋白水解酶水平，有效改善血清和脑组织中的炎症，其中，在手术后立即给药较晚期给药对炎症水平的调控作用更明显。但是血清中炎症因子早期给药组较晚期给药组的作用无明显差异。这可能是因为组织学中炎症因子变化更敏感。

本研究中炎症因子蛋白表达的结果从另一个角度证实了MC能够通过抗炎发挥神经保护作用。其中MC治疗组炎症因子表达明显降低，但是早期给药组较晚期给药组炎症因子IL-1β、TNF-α降低更为明显，与血清中炎症因子变化规律相同。MC治疗组抗炎因子表达明显升高，其中晚期给药组较早期给药组抗炎因子水平无明显差别，这与血清中炎症因子水平无明显差别相匹配。Wixey等[15]的研究表明MC在缺血再灌注后降低脑组织炎症因子的作用不仅在再灌注后短期存在，并可持续致缺血再灌注后6周。但本研究进一步证实了早期给药抑制炎症因子的作用更明显，有助于指导临床给药时相的选择。

生理盐水组紧密连接蛋白ZO-1、occludin、claudin-5表达显著降低；与生理盐水组比较，MC治疗组紧密连接蛋白表达明显升高，其中早期给药组较晚期给药组作用更为明显，说明了MC通过促进紧密连接蛋白的表达修复BBB。激活的紧密连接蛋白的表达能够修复BBB，保护血管生成[16]。实验结果显示，MC对紧密连接蛋白和血管生成蛋白的表达具有上调作用，说明MC能够通过促进紧密连接蛋白和血管生成蛋白发挥神经保护作用，且在手术后立即给药较晚期给药对血管和脑功能的保护作用更明显。与假手术组比较，生理盐水组大鼠组织标记血管新生的RECA-1和PDGFR-β强度变弱，表达明显减少，与生理盐水组比较，MC治疗组大鼠组织RECA-1和PDGFR-β表达明显上调，其中，早期给药组较晚期给药组促进血管新生的作用更为明显。SWI可以半定量显示梗死灶内新生血管，结果与RECA-1和PDGFR-β相符合，为内源性BBB重塑可视化提供无创性工具。

Iba-1 特异性表达于小胶质细胞/巨噬细胞，并在缺血性脑卒中的脑组织中高表达[17]，结果显示Iba-1荧光标记显示在生理盐水组中Iba-1表达的强度明显增强，MC治疗降低了Iba-1的表达，且早期给药组较晚期给药组对Iba-1表达的降低作用更明显，MC抑制了脑缺血后小胶质细胞的聚集和激活发挥抗炎作用；免疫组化结果显示生理盐水组CD11b标记的阳性细胞明显增多且形态大小不均一；MC治疗组CD11b染色强度变弱，数量减少；早期给药组较晚期给药组对CD11b的抑制作用更为明显，说明MC能够抑制小胶质细胞/巨噬细胞的活化，发挥抗炎作用，早期给药组较晚期给药组抑制效果更好。

综上所述，本研究证实了MC通过抑制脑卒中后炎症反应及小胶质细胞/巨噬细胞活化，促发局部血管再生，从而有效降低MCAO诱导的缺血再灌注损伤、降低梗死体积及减轻神经功能损伤，且早期给药较晚期给药效果更好；MRI-SWI有助于无创性可视化判断缺血性脑卒中BBB重塑。为MC给药时相的选择提供理论基础，并为监测缺血再灌注损伤及BBB重塑提供可视化依据。