以本地早橘和槾橘为母本倍性杂交创制柑橘三倍体

解凯东，彭珺，袁东亚，强瑞瑞，谢善鹏，周锐，夏强明，伍小萌，柯甫志，刘高平，GROSSER Jude W，郭文武

以本地早橘和槾橘为母本倍性杂交创制柑橘三倍体

解凯东1，彭珺1，袁东亚1，强瑞瑞1，谢善鹏1，周锐1，夏强明1，伍小萌1，柯甫志2，刘高平3，GROSSER Jude W4，郭文武1

（1华中农业大学园艺林学学院/园艺植物生物学教育部重点实验室，中国武汉 430070；2浙江省农业科学院柑桔研究所，中国浙江台州 318020；3浙江省台州市黄岩区果树技术推广总站，中国浙江台州 318020；4美国佛罗里达大学柑橘研究与教育中心，美国佛罗里达 33850）

【】基于二倍体与四倍体倍性杂交策略创制柑橘三倍体新种质。以二倍体为母本，四倍体为父本进行人工授粉，授粉后85 d采摘幼果并对未成熟种子实施幼胚离体挽救培养；再生植株后，用流式细胞仪和根尖染色体计数法对再生植株进行倍性鉴定；并用SSR标记对三倍体后代进行分子鉴定。以本地早橘和槾橘为母本，8个异源四倍体体细胞杂种和1个双二倍体为父本，配置9个倍性杂交组合，共授粉2 749朵花，坐果489个，平均坐果率17.8%；培养幼嫩种子2 239粒，经幼胚离体挽救培养，共再生植株260株；用流式细胞仪和根尖染色体计数检测再生植株倍性，获得三倍体141株；SSR分子鉴定表明从槾橘×NS组合随机选取的50株三倍体后代全部为双亲的有性后代；三倍体后代在温室生长一年后，采用嫁接（枳砧）将这些三倍体定植于田间。这些三倍体新种质为本地早橘和槾橘无核新品种培育奠定了宝贵的材料基础。

柑橘；无核育种；三倍体；幼胚离体挽救培养；流式细胞仪

0 引言

【研究意义】柑橘是世界第一大水果，也是我国南方栽培面积最广、经济地位最重要的果树，在乡村振兴和精准扶贫方面发挥着重要作用[1]。我国柑橘主要供应鲜果市场，无核果实由于食用方便、品质佳，愈发受消费者青睐[2-3]。虽然我国柑橘地方品种繁多，但多数有核，难以满足当今市场对无核优质果实的消费需求。因此，果实无核化是解决我国特色柑橘无核品种匮乏和提升地方品种商品价值的重要手段。【前人研究进展】本地早橘和槾橘均原产我国，本地早橘为早熟品种，味甜少酸，汁多化渣；槾橘是一个品质较优的晚熟鲜食品种。两者在浙江均有百年以上栽培历史，曾是当地大力发展的主栽品种。但由于其种子较多和长期无性繁殖引起的种性衰退，两者果实品质严重下降。特别是国外一些无核品种的引进和种植，对本地早橘和槾橘的冲击较大，导致其栽培面积大范围缩减[4]。三倍体雌雄配子败育，是天然的不育类型，且其不育性状不受环境影响，是培育无核柑橘的重要手段[5]。柑橘中，二倍体为母本，与四倍体为父本的倍性杂交是培育三倍体最经典的策略[6]。基于该策略，美国、意大利、西班牙、日本和中国等国的科研工作者培育出了大量柑橘三倍体，并成功选育出一批表现优良的无核新品种[2-3,7-12]。【本研究切入点】近年来，柑橘细胞工程育种技术（包括体细胞杂交和同源四倍体快速发掘技术）飞速发展，新获得了大批柑橘异源四倍体体细胞杂种和同源四倍体[7,13-15]，为柑橘倍性杂交创制无核三倍体提供了优良的育种亲本。异源四倍体体细胞杂种包含两个融合亲本的全部遗传物质，综合了其双亲优良性状，如体细胞杂种‘Succari甜橙+Page橘柚’果实风味佳，少核且早熟[16]，以其为父本倍性杂交创制的三倍体后代可能兼具3个亲本的优良性状，遗传变异丰富，有利于筛选果实品质性状优良且无核的柑橘新品种。【拟解决的关键问题】本研究以浙江黄岩地方品种本地早橘和槾橘为母本，与8个柑橘异源四倍体体细胞杂种和1个双二倍体为父本倍性杂交，结合幼胚离体挽救培养和流式细胞仪倍性分析，创制一批具有丰富遗传变异的三倍体植株，为我国柑橘无核新品种培育奠定宝贵的材料基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2014—2018年，以柑橘单胚性品种—槾橘（Hort. ex Tan）和单、多胚混合型品种—本地早橘（Hort. ex Tanaka）为母本，异源四倍体体细胞杂种NS（Blanco ×Macf. +L. Osbeck）[7]、SP（L. Osbeck +Blanco ×Macf.）[7]、MD（Blanco ×L. Osbeck +Blanco）[16]、SM（L. Osbeck +Blanco ×L. Osbeck）[7]、PL（Blanco ×Macf. +Blanco）[16]、PM（Blanco ×Macf. +Blanco ×L. Osbeck）[16]、VP（L. Osbeck +Blanco ×Macf.）[17]、PCS（Blanco ×Macf. +Hort. ex Tanaka ×）[16]和Succari甜橙（L. Osbeck）双二倍体（4x Suc）为父本，配置9个倍性杂交组合。所有四倍体花粉均采自华中农业大学柑橘研究所种质资源圃。本地早橘授粉地点为华中农业大学柑橘研究所种质资源圃；槾橘授粉地点为浙江省农业科学院柑桔研究所试验基地。

1.2 花粉制备及人工授粉

柑橘初花期，采摘四倍体父本即将开放的花带回实验室，用镊子将花药剥下后铺于有滤纸的培养皿，并将其置于烘箱28℃烘1—2 d，待花粉完全干燥后，将其收集至离心管后置于-20℃冰箱保存备用。人工授粉在柑橘盛花期前进行，选取生长健壮、花量大的枝条进行标记，将已开花和小花蕾全部去掉，枝条上仅保留待授粉的花；用镊子人工去雄后，用小毛笔蘸取少量父本花粉均匀涂于待授粉花的柱头上。若授粉后8 h内下雨，需重新授粉一次。

1.3 幼胚离体挽救培养

幼胚离体挽救培养参考Xie等[12]的方法。采摘授粉后85 d的幼果带回实验室，无菌条件下将幼果浸泡于75%酒精消毒15 min，之后再置于酒精灯上燃烧消毒，酒精燃烧完后将果实剖开剥取出未成熟种子。为提高种子萌发率，将其种皮从合点端切开并向珠孔端轻轻撕至幼胚暴露，再将处理后的种子接种至萌发培养基（MT培养基+1 mg∙L-1GA3）。光照培养室培养1个月后，将形成的胚状体置于生芽培养基（MT + 0.5 mg∙L-1BA + 0.5 mg∙L-1KT + 0.1 mg∙L-1NAA）中增殖生芽；待其长出2—3片叶后将茎切下，置于生根培养基（1/2 MT + 0.1 mg∙L-1IBA + 0.5 mg∙L-1NAA + 0.5 g∙L-1活性炭）中诱导生根。培养条件：温度：（25±1）℃；湿度：70%左右；光照强度：40 µmol∙m-2∙s-1；光照时间：16 h/天。

1.4 再生植株倍性分析

流式细胞仪（Sysmex，Japan）倍性分析参照解凯东等[2]的方法。以二倍体母本叶片为对照，取待测样品0.5 cm2大小的叶片于塑料皿中，加入200 µL细胞裂解液（Precise-P，Sysmex），并用刀片将其充分切碎；加入800 µL DAPI染色液（Precise-P，Sysmex）后，用33 µm微孔滤膜将样品过滤到2.5 mL试管并上机检测。样品倍性分析图像由Flomax软件（Sysmex，Japan）自动生成。

根尖染色体计数参考LAN等[18]的方法。取1.5 mm左右生长旺盛的根尖，用饱和对二氯苯20℃预处理2—4 h；0.075 mol∙L-1KCl低渗处理30 min后，用新鲜的卡诺固定液（无水乙醇﹕冰乙酸 = 3﹕1）室温下固定24 h，最后置于70%乙醇中4℃保存备用。制片前，将根尖用磷酸缓冲液清洗干净，并置于2%纤维素酶 + 2%果胶酶（1﹕1）混合酶液中，37℃下处理1 h左右；酶解结束后，吸取1—2个根尖于干净的载玻片上，滴1滴1%卡宝品红染液染色1 min后盖上盖玻片，用铅笔均匀敲打盖玻片直至材料分散均匀，最后用Olympus DP70显微镜镜检并拍照。

1.5 植株移栽及嫁接

移栽前将植株置于试管中室温下炼苗3—5 d，之后将其移入小塑料杯，待其成活后再移入大营养钵并置于温室。苗期需加强管理，保证幼苗的正常生长。植株在温室生长1年后，次年8月下旬取其木质化的枝条为接穗，以枳为砧木将其嫁接于田间（枳砧提前定植）。

1.6 SSR分子鉴定

基因组DNA提取参照CHENG等[19]的方法，DNA浓度和质量用NanoDrop 1000紫外分光光度计（Thermo Scientific，USA）检测。DNA原液用TE缓冲液稀释至约50 ng∙µL-1。SSR引物（表1）由上海生工生物工程股份有限公司合成。SSR分析方法具体如下：PCR体系为10 µL：2×PCR反应mix（Vazyme）5 µL，正反向引物各0.1 µL，DNA模板1 µL，灭菌超纯水3.8 µL。PCR反应在ProFlex PCR仪（ABI，USA）上进行，扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性60 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，32个循环；72℃延伸7 min；最后12℃保存。扩增完成后，PCR产物在恒定电压95 V条件下，用2.5% Metaphor琼脂糖凝胶（Lonza，USA）电泳约1 h后用凝胶成像系统（BIO-RAD，USA）拍照。

表1 3对SSR引物序列

2 结果

2.1 授粉、胚抢救及植株再生

以二倍体槾橘和本地早橘为母本，8个异源四倍体体细胞杂种和1个双二倍体为父本，配置了9个倍性杂交组合（表2）。其中，以槾橘为母本，NS为父本配置了1个组合；以本地早橘为母本，7个异源四倍体（MD、SM、SP、PL、PM、VP、PCS）及双二倍体4x Suc为父本，配置8个杂交组合。由表2可知，9个杂交组合共授粉2 749朵花，坐果489个，平均坐果率17.8%。其中以本地早橘为母本的组合坐果率较低，介于10.3%—26.4%；而槾橘×NS坐果率较高，为42.9%。9个组合共离体培养未成熟种子2 239粒，其中以槾橘为母本培养种子267粒，以本地早橘为母本培养种子1 972粒。经幼胚离体挽救培养，9个组合共再生植株260株，平均植株再生率11.6%；其中，以本地早橘为母本的8个组合再生植株181株，植株再生率介于3.2%—37.1%；槾橘×NS组合再生植株79株，植株再生率29.6%。幼胚离体挽救培养、植株再生及田间嫁接过程见图1。

表2 以本地早橘和槾橘为母本的倍性杂交组合及植株再生

a：授粉后85 d的种子（下）及对照种子（上）；b：接种于萌发培养基的种子；c：种子萌发形成胚状体；d：生芽培养；e：生根培养；f：植株炼苗；g：移入小塑料杯的三倍体；h：移入温室的三倍体群体；i：嫁接至田间的三倍体植株（枳砧）

2.2 再生植株倍性分析

用流式细胞仪对所有再生植株进行倍性分析（图2），表明以单胚性槾橘为母本再生的79棵植株，经检测全部为三倍体（表2），三倍体获得率100%。以单、多胚混合型本地早橘为母本的8个杂交组合再生的181棵植株，经检测三倍体有62株（表2），三倍体获得率34.3%。此外，从‘槾橘×NS’组合随机挑选3株三倍体用于根尖染色体计数分析，表明三倍体染色体均为27条，验证了流式细胞仪倍性检测的准确性。上述多倍体在温室生长一年后，已全部嫁接于田间。

2.3 三倍体后代的分子鉴定

用3对SSR引物对‘槾橘×NS’组合中随机选取的50株三倍体后代进行分子鉴定，显示50株三倍体后代均含有父母本特异条带，表明所有检测的三倍体后代均为双亲的有性后代（图3）。

a：流式细胞仪倍性鉴定（PK1=50，二倍体；PK2=75，三倍体）；b、c：根尖染色体计数（b：二倍体，2n=2x=18；c：三倍体，2n=3x=27），标尺=5 µm

引物Mest88的扩增谱图；M：槾橘；F：NS；1—50：三倍体后代 SSR profile of primer Mest88; M: Man tangerine; F: NS; 1-50: The triploid progenies

3 讨论

柑橘是我国南方果树主导产业之一，栽培历史悠久，资源丰富，地方良种多；但我国目前规模化栽培的80余个柑橘品种，约一半引自国外[21]。特别是一些优质的无核品种，如温州蜜柑、纽荷尔脐橙、伦晚脐橙、红美人等，在我国柑橘产区大面积引种栽培，导致一些地方特色品种，如本地早橘和槾橘的栽培面积逐年缩减。果实有核和品质衰退可能是导致这些品种在市场上面临淘汰的根本原因。柑橘长期无性繁殖容易感染并积累病毒，导致果实品质降低[22]，难以满足消费者对品质提升的需求。与有核果实相比，无核果实食用方便，倍受消费者青睐。因此，采用合理的育种手段，实现果实无核和其他品质性状的综合改良（或提纯复壮）是有效提升这些地方品种市场竞争力的重要保障。

与二倍体果树相比，三倍体由于细胞核内染色体增加了一套，其形态和生理往往会有一些新的变化，通常表现为器官巨大、育性降低、新陈代谢旺盛和对环境适应性增强等。如三倍体梨新品种‘华幸’[23]、‘华香酥’[24]均表现为果大、品质优和抗黑心病等特点；三倍体枇杷‘华玉无核1号’果实无核，可溶性固形物含量高，丰产性好[25]。而柑橘三倍体除表现果实无核外，部分三倍体优系在抗逆性[26-27]、成熟期调控[28-29]和功能性成分代谢[30-31]及抗氧化活性[32]等方面也表现出优异的应用价值。就柑橘而言，由于多数品种单性结实能力强，不用担心由于三倍体育性降低而导致坐果难的问题；而柑橘等果树多数以无性繁殖为主，通过培育三倍体实现无核和其他优良性状结合，一旦改良成功，即可长期持续利用。如西班牙为解决柑橘果实有核和市场周年供应等问题，采用倍性杂交培育三倍体的策略，成功培育出‘Sofar’‘Garbí’‘Alborea’和‘Albir’等几个成熟期不同的三倍体新品种且大面积栽培，填补了西班牙柑橘鲜果市场1—3月份的空白[28-29,33]。美国科学家针对柚和葡萄柚含有呋喃香豆素的问题，以柚为母本，与葡萄柚同源四倍体（父本）倍性杂交，成功培育出一个呋喃香豆素含量很低，无核、果实风味好且无苦味的三倍体葡萄柚新品种，在美国已商业化种植[34]。因此，培育三倍体在柑橘遗传改良中具有巨大的应用潜力。

本研究基于2x×4x倍性杂交策略，以本地早橘和槾橘为母本培育三倍体，是实现这两个品种无核遗传改良的有效方法。近20年来，虽然国内外在柑橘三倍体无核育种方面取得了一定进展，但针对本地早橘和槾橘有核性状创制三倍体的报道较少；除美国外，国外多数国家倍性杂交主要以同源四倍体为父本[8-10]。本研究选用的四倍体父本大多数为2个优良二倍体品种经原生质体融合再生创制的异源四倍体体细胞杂种，与同源四倍体相比，异源四倍体体细胞杂种综合了双亲的遗传物质，以其为父本与本地早橘和槾橘倍性杂交获得的三倍体后代不仅果实无核，而且可能兼具3个优良二倍体亲本的遗传物质，遗传变异丰富，有利于培育无核且其他性状（如高糖、极早熟、易剥皮等）优良的柑橘新品种。

前期研究发现，以本地早橘为母本倍性杂交，其坐果率和植株再生率均较低[3]，但以其为母本创制的三倍体后代果实不仅无核，且部分株系果实表现出极易剥皮或与亲本相比成熟期提前等优点（武汉地区9月中旬果实已转色，数据未发表），表明本地早橘在培育柑橘极早熟和易剥皮品种方面是一个优良的二倍体育种亲本。因此，为获得一定数量的具有丰富遗传变异的本地早橘三倍体后代，本研究以其为母本配置了8个杂交组合，这8个组合坐果率（10.3%—26.4%）、植株再生率（3.19%—37.14%）确实较低，与笔者前期结果一致，可能与本地早橘品种特性有关。与本地早橘相比，以槾橘为母本不仅坐果率高，且易再生三倍体；但槾橘在本研究中是第一次用作亲本创制三倍体，其三倍体后代果实性状表现如何正在评价中；若田间反馈信息表明其为较好的育种亲本，未来将以其为亲本配置更多倍性杂交组合，用于柑橘无核三倍体新品种的培育。

4 结论

基于柑橘幼胚离体挽救培养和流式细胞仪快速倍性检测技术，从9个倍性杂交组合共再生三倍体141株，分子鉴定结果表明所有检测的三倍体后代均为有性杂种，为本地早橘和槾橘无核遗传改良奠定了宝贵的材料基础。

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Production ofTriploids Based on Interploidy Crossing with Bendizao and Man Tangerines as Female Parents

XIE KaiDong1, PENG Jun1, YUAN DongYa1, QIANG RuiRui1, XIE ShanPeng1, ZHOU Rui1, XIA QiangMing1, WU XiaoMeng1, KE FuZhi2, LIU GaoPing3, GROSSER Jude W4, GUO WenWu1

(1College of Horticulture & Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology (Ministry of Education), Wuhan 430070, China;2Citrus Research Institute, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Taizhou 318020, Zhejiang, China;3Huangyan Fruit Tree Technology Promotion General Station, Taizhou 318020, Zhejiang, China;4Citrus Research and Education Center, IFAS, University of Florida, Lake Alfred FL 33850, USA)

【】The aim of this study was to create the citrus triploids based on diploid and tetraploid ploidy cross strategy.【】The artificial pollination was conducted with diploid as female parent and tetraploid as male parent. Young fruits were sampled at 85 d after pollination (DAP) and immature seeds were extracted and subjected toembryo rescue. Following plantlet regeneration from the embryos, their ploidy level was determined by flow cytometry and root-tip chromosome counting, as well as the genetic origin determined using simple sequence repeat (SSR) markers. 【】A total of nine interploidy crosses were carried out by using Bendizao tangerine and Man tangerine as female parents and eight allotetraploid somatic hybrids and one doubled diploids as male parents. From all crosses, 2 749 flowers were pollinated and 489 fruits were set, with an average fruit setting rate of 17.8%. By conductingimmature embryo rescue, totally 260 plants were regenerated from 2 239 seeds cultured. By determining their ploidy level using flow cytometry and root-tip chromosome counting, 141 seedlings were proven to be triploids. SSR analysis showed that all of 50 randomly selected triploid plants from Man tangerine × NS were the hybrids of their both parents. After one year growing in greenhouse, all triploids were grafted ontoin the field to accelerate flowering. 【】These triploid citrus plants obtained herein provided elite materials for potential seedless variety selection.

; seedless breeding; polyploid; embryo rescue; flow cytometry

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.23.020

2020-09-01；

2020-10-14

国家自然科学基金国际合作重点项目（31820103011）、湖北省科技支撑计划（2020BBA036）、广东省科技计划（2018B020202009）、中央高校基本科研业务费专项资金（2662019QD048，2662018PY007）

解凯东，Tel：027-87287393；E-mail：xiekaidong@mail.hzau.edu.cn。通信作者郭文武，E-mail：guoww@mail.hzau.edu.cn

（责任编辑 赵伶俐）