变应性接触性皮炎交叉反应研究方法

李颖芳，邹颖

变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)是患者致敏后再次接触相同致敏物发生的迟发型超敏反应，在接触部位及邻近部位产生皮肤损害。ACD常由化工产品引起，找到致敏物并指导患者避免再次接触，是治疗和预防ACD的首要措施[1]，斑贴试验在诊断ACD以及寻找相关致敏原过程中起到重要作用。但由于分子结构相似的致敏原间存在交叉反应(cross reactivity, CR)，选择安全的替代产品变得更加困难，患者在生活工作中不可避免地长期反复接触致敏原，使得病情迁延，严重影响生活质量[2]。

交叉反应的发生是具有相似抗原表位的过敏原产生的分子模拟效应，过敏原抗原表位刺激机体产生的抗体，不仅可与该过敏原表面相应的抗原表位结合，还能与其他具有相似抗原表位的过敏原结合而诱发过敏反应。但仅有相同的化学基团不足以产生交叉反应，受体分子对抗原表位的空间形状和体积也是高度敏感的，故产生交叉反应的抗原必须具备相近的分子大小和空间几何形状。例如山慈菇内酯与土木香内酯虽然有相同的化学基团α-亚甲基-γ-丁内酯，但因二者空间体积大小相差较多，故并不产生交叉反应[3]。过敏原的交叉反应主要有以下4种模式：(1)过敏原A和过敏原B具有相近的化学基团和空间结构；(2)过敏原A的中间代谢产物与过敏原B具有相近化学基团和空间结构；(3)过敏原B的中间代谢产物与过敏原A具有相近化学基团和空间结构；(4)过敏原A和B 的中间代谢产物化学基团、空间结构相近[4]。

实际情况中确定过敏原间存在交叉反应是比较困难的，需要排除伴随过敏(concomitant sensitization)和多重过敏(polysensitization)才可下结论[5-6]。伴随过敏是指分子结构不同的致敏原A与B常同时伴随出现，过敏反应发生时往往二者同时存在，例如镍和钴常发生伴随过敏反应，因钴作为杂质常与镍同时存在于一些合金产品中[7]。多重过敏是指患者对多种化学结构不相似的过敏原敏感[8]。除了伴随过敏和多重过敏需要考虑并排除外，物质的代谢过程也需要特别关注，物质的代谢是非常复杂的过程，两个结构完全不同的物质，在代谢后可以转变为具有相似结构的中间产物，从而引起交叉反应。

为了鉴别过敏原间的交叉反应和伴随过敏反应，许多研究在这方面做出了努力。

1 分子模型

分子模型(molecular modelling)被认为是分析过敏原交叉反应的有效方法，主要用于研究构象依赖性药物-受体相互作用和构效关系，该方法需要大量临床数据和相关分子结构数据作为基础[9-10]。Coopman等[11]采用该方法研究了皮质类固醇激素间交叉反应情况，研究根据皮质类固醇激素的分子结构将其分成4组，A组为氢化可的松、巯氢考的松等相似结构化合物,B组为曲安奈德、安西奈德等相似结构化合物，C组为倍他米松、地塞米松等相似结构化合物，D组为酯类，如氢化可的松17丁酸酯和氯倍他酮17-丁酸酯等，结合大量皮质类固醇激素斑贴试验情况，发现A、B、D组分子具备各组的体积和形状结构特征，组内分子间存在交叉反应现象，不同组别的分子间不存在交叉反应。为了有效地进行构效关系研究总结出交叉反应分子模型，需要大量的分子数据支持，故该方法暂未得到广泛运用。

2 重复斑贴试验

Rustemeyer等[12]采用重复斑贴试验(retesting)的方法研究过敏原的交叉反应，研究发现过敏原A在初次斑贴试验时，会在试验处产生抗原特异性的T淋巴细胞，使得该处皮肤产生“皮肤记忆”[13]，随后与过敏原A存在交叉反应的过敏原B在相同部位进行斑贴试验时，会产生高敏感性，表现为试验第4～6 h即可达到敏感高峰，于斑贴部位出现红斑。但该方法局限在临床观察，未能在细胞分子层面进行分析，亦存在一定局限性。

3 局部淋巴结分析法

局部淋巴结分析法(local lymph node assay，LLNA)被越来越多地用于分析过敏原交叉反应[14-15]，简单概述该方法：在小鼠耳背连续涂抹致敏物3天诱导接触过敏，随后在第10天于小鼠耳背外涂抹被检测过敏原A和B(注意过敏原A和B必须通过纯度分析，排除杂质干扰)，在第12 天将小鼠处死取出引流耳后淋巴结，用流式细胞仪分析淋巴细胞分类情况，同时可根据小鼠耳部皮肤厚度评判炎症程度。取出不同致敏物干预后的小鼠淋巴结，经流式细胞仪分析其细胞分类情况无统计学差异时，认为这些过敏原间存在交叉反应。但仅根据局部淋巴结分析结果判断其交叉反应尚不够充分，Aalto-Korte等[16]认为需要结合斑贴试验结果综合分析，并且斑贴试验样本量需要足够大，而避免产生数据偏移，此外该方法亦缺乏分子层面的研究。

需要注意的是，再次斑贴试验法和局部淋巴结分析法判断交叉反应时，过敏原浓度也在一定程度上影响结果。浓度过低使得过敏原的交叉反应不容易被察觉，而浓度过高则可能引起刺激反应，从而影响结果判读。例如Aerts等[17]认为在研究甲基异噻唑啉酮(methylisothiazolinone, MI)与辛基异噻唑啉酮(octylisothiazolinone, OIT)的交叉免疫反应时，发现0.025%的OIT浓度太低，使得交叉反应的结果被影响，故测试浓度应该高于0.025%，但OIT浓度达到0.2%可能引起刺激反应而影响试验结果，所以选取合适的试验浓度也非常关键。

4 重构人表皮模型

近年来，3D重构人体表皮(reconstructed human epidermis，RHE)被认为是研究过敏原交叉反应的重要方法[18]，该方法采用同位素作为探针标记致敏物，使用高分辨率魔角旋转核磁共振技术(high-resolution magic angle spinning nuclear magnetic resonance technique，HRMAS NMR)观察致敏原在重构人表皮模型中的原位化学作用[19]。RHE模型与人体表皮的形态和代谢活动有高度相似性，结合HRMAS NMR技术观察致敏原与表皮细胞的原位相互作用，了解致敏物与皮肤蛋白和氨基酸化学反应的特异性。MI和甲基氯异噻唑啉酮(methylchloroisothiazolinone, MCI)在化学结构上相似度高，普遍认为二者间存在交叉反应，但Debeuckelaere等[20]采用RHE模型研究发现MI与MCI存在不同的化学选择性，且最终产生的加合物的空间结构亦不相同，故其认为二者交叉反应不成立。另外，研究中对于加合物结构的认识，也将有助于分子模型方法的数据积累。但该方法对设备、技术的要求较高，目前采用3D重构人体表皮模型研究交叉反应的报道并不多。

5 结语

变应性接触性皮炎长期反复发作严重影响患者生活质量，日常生活中严格规避过敏原会较好改善病情，但过敏原间交叉反应的存在，将严重影响过敏原规避效果，因此明确交叉反应物意义重大。目前对于交叉反应的研究方法较多，然而缺乏准确有效且经济的检测方法，使得存在交叉反应的过敏原尚未被全面准确地认识，该方面的工作值得进一步深入探索。