规模化奶牛场牛病毒性腹泻流行病学调查与防控

郭启勇，柳国锁，黄海碧，吴心华*

(1. 宁夏大学农学院，宁夏 银川 750000；2. 金宇保灵生物药品有限公司，内蒙古 呼和浩特 010000)

牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)感染引起的一种传染病[1-2]。BVDV是黄病毒科瘟病毒属的成员[3-4]。BVD病程复杂，临床症状和亚临床症状多样，主要表现为呼吸系统、生殖系统、消化系统和生产性能等机能破坏，并导致免疫抑制[5-6]。BVDV主要感染牛、绵羊、山羊、鹿等动物，多数表现为隐性感染。新生犊牛经常因为腹泻而死亡[7-8]。牛病毒性腹泻在临床上经常表现为混合感染，由于病毒感染后，导致牛群排毒造成持续性感染，临床表现多样，在不同的时期感染具有不同的临床表现，怀孕母牛感染BVDV可以通过胎盘传给胎儿[9-10]。BVDV感染牧场之后，由于防控困难。给牧场带来极大的经济损失和资源浪费，世界上每年每头牛损失50～500美元，平均大约46.5美元；欧洲的经济损失大概每年达到87美元[11-12]。中国目前为止没有关于经济损失方面的研究和分析。BVDV 1946年在纽约州首次发现[13]，该病毒属的病毒具有交叉感染性，猪的猪瘟病毒可以传染给牛，牛的病毒性腹泻可以传染给猪、绵羊、山羊、骆驼、鹿、羚羊等[14-15]。

国外分为3个阶段进行逐步净化：第一个阶段，加强牧场生物安全的防范措施，对周围环境做定时、定期、定量的消毒，对引进的牛群严格按照OIE标准进行检测，对于阳性牛立即淘汰，减少损失。做到安全隔离，禁止和牧场的接触，预防出现持续性感染牛(PI)。第二阶段有计划有目标的严格筛查PI牛，筛查之后，应该尽快清除。第三阶段，对健康牛进行检测。总结各国经验，清除PI牛是整个防控中最为严格和重要的一步。疫苗免疫虽然是提高牛的免疫力，但是无法阻止PI牛的出现和排毒。疫苗免疫有两种形式存在，一种是筛查和淘汰，存在于奥地利、瑞士以及北欧的一些国家;另外一种就是免疫和淘汰，在养殖密集区域、疫病高发区域、动物流动率高的地区多进行疫苗免疫。

为了解BVD在规模化奶牛场中的流行情况，采用ELISA检测对奶牛养殖密集区域的银川市、中卫市、吴忠市、石嘴山市、固原市等规模化奶牛场的奶牛血清样品进行抗体检测，对599份犊牛样品采用荧光定量PCR进行病原检测，为规模化奶牛场的防控工作提供数据参考。同时选择一个规模化牧场做防控示范场研究，为以后本病的防控提供实践经验。

1 材料与方法

1.1 样品

2018年9月到2019年6月，采集宁夏30个未进行疫苗免疫牧场的1 500份血样，599份腹泻犊牛的粪便、鼻拭子、肛拭子及死亡犊牛的脾脏组织样品。

1.2 试剂

牛病毒性腹泻抗体检测试剂盒和抗原快速检测卡(美国爱德士公司)、AxyprepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit(AXYGEN)、Premix TaqTM(TaKaRa)、无酶水、无水乙醇等。

1.3 牛病毒性腹泻的抗体检测

严格按照爱德士ELISA抗体试剂盒说明书进行操作。

1.4 病料处理

在生物安全柜内处理。取大约5 mg的组织病料放置到2 mL带有钢珠的离心管中，用剪子尽可能剪碎。用组织研磨仪研磨裂解组织。加入PBS进行稀释，取1 mL放入2 mL离心管中。编号，置于-20 ℃冰箱中。鼻拭子和肛拭子样品在超净工作台中加入定量的PBS溶液，漩涡振荡，吸取1 mL放入离心管中编号，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4.1 病料的总DNA提取

采用TaKaRa MinBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒，提取病料组织中的总RNA。

1.4.2 荧光定量PCR

根据GenBank中登陆的BVDV的基因序列，利用DNAStar软件MegAlign模板分析选择Ⅰ型的5'UTR保守序列，引物由北京华大基因工程公司合成，探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。

表1 荧光定量PCR引物与探针

1.4.3 扩增体系

以已获得的DNA为模板，加入RT-PCR buffer Ⅲ 12.5 μL，ExTaqHS 0.5 μL， PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，上下游引物(20 μmol/L) 各 1.0 μL，Ⅰ型1.0 μL，模板核酸 2 μL，加无酶水补充至 25 μL。扩增条件为：反转录 51 ℃ 15 min；94 ℃ 2 min；PCR 反应 94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，45个循环。经优化后荧光定量PCR检测方法的阴性对照无Ct值，BVDV阳性对照Ct值小于30，扩增曲线呈现典型的S型曲线。

结果判定标准：(1)阴性、阳性对照成立，R2>0.990，试验成立。(2)结果判定：若被检样品出现S型扩增曲线，且Ct值为10～35，则结果为阳性；若3537，则判定为阴性。

1.5 防控方法

选择宁夏吴忠的一个3 000头规模未进行疫苗免疫的血清学阳性奶牛场，使用爱德士公司生产的BVDV抗原快速检测卡进行检测。无菌采集未断奶犊牛耳组织，根据产品说明书进行操作。

全群BVDV抗原检测，成年母牛使用ELISA方法检测，犊牛使用快速检测卡检测。阴性牛回归群体，阳性牛隔离，21 d后重复送样检测，阴性牛回归群体，阳性牛淘汰。

1.6 数据统计

试验数据使用Microsoft Excel 2019进行统计。

2 结果

2.1 规模化奶牛场抗体检测

2.1.1 不同地区抗体检测结果

对宁夏地区规模化奶牛场的1 500份进行了BVD抗体的检测，结果见表2。共检出1 314份阳性血清样品，阳性率为87.6%。银川市感染率最高为94.80%，固原市感染率最低为59.87%。

表2 宁夏地区不同地区血清抗体检测阳性率

2.1.2 不同生长时期牛群的BVD抗体阳性率

根据奶牛的生长时期分为犊牛(0～6月龄)、青年牛(6～18月龄)和成年母牛(18月龄以上)。不同时期血清抗体检查阳性率结果见表3。犊牛的血清抗体阳性率为83.33%，青年牛的血清抗体阳性率为84.08%，成母牛的血清抗体阳性率88.98%。

表3 不同生长时期血清抗体检测阳性率

2.2 BVD病原检测

从宁夏回族自治区规模化奶牛场抽样无菌采集599头具有腹泻症状犊牛的粪便、鼻拭子、肛拭子、脾组织样品经过处理后，用RT-PCR进行BVD病原检测，结果见表4。显示抗原阳性样品数为16份，阳性率为2.67%，其中吴忠市的阳性率最高为4.42%，固原市未检出阳性。

表4 不同地区的BVD抗原检测结果

2.3 示范防控场BVD监测

2019年8月对规模牧场300多头未断奶犊牛进行耳组织采集检测，检测结果发现阳性率为0.6%。PI牛的淘汰是规模化牧场防控病毒性腹泻最好的防护方式，相对于接种疫苗预防而言，具有减少工作时间和减少经济支出的优势。2019年9月至11月对该牧场腹泻死亡的病料进行荧光定量PCR检测，结果发现阳性率为0，说明该牧场病毒性腹泻的防控有效。

3 讨论

改革开放以来，我国的养殖业发生了翻天覆地的变化，从原始的小农户生产变成了初具规模的农牧公司生产。其中，奶牛养殖变化明显，从以前小农户养殖变成了规模化、集约化的公司化养殖。由于我国原始品种不能充分满足消费者的需求，因此大量从国外引种。贸易和集约化的养殖方式虽然提高了经济效益，但也加快了疾病传播。牛病毒性腹泻是一种以水平传播为主的疾病，由于病毒特性，一旦在牧场存在便很难清除[16-18]。犊牛容易造成持续性感染，病牛初期没有明显的临床症状，牧场兽医很难通过临床表现做出准确的诊断。病牛持续向牧场排毒，造成牧场的永久性污染。病毒性腹泻在牧场盛行，极大地降低了犊牛的成活率。BVD导致牛淘汰之后，牧场的牛不能得到及时补充，存栏量下降，而且本病一旦进入牧场便长期存在。

本次试验共检测牛血清1 500份，其中血清抗体阳性的牛有1 314头，抗体阳性率高达87.6%。其中犊牛抗体阳性率为83.33%，青年牛抗体阳性率为84.08%，成母牛抗体阳性率88.96%。对599份犊牛样品应用荧光定量PCR进行病原检测，其中阳性16份，阳性率为2.67%。1999年对西北地区牛病毒性腹泻流行病学调查结果显示，宁夏地区病毒性腹泻血清抗体阳性55.95%[16]；2015年对宁夏地区病毒性腹泻流行病学调查发现，血清抗体阳性率高达64.92%[17]；2016年对宁夏地区奶牛疑似病毒性腹泻的牛采取了135份耳组织，进行抗原检测，阳性率最高0.5%，平均0.01%[18]。说明我国规模化牛场BVD感染严重，并且逐年呈上升趋势，制定有效的防控措施迫在眉睫。

根据宁夏地区规模化奶牛场BVD的流行情况来看，阳性率普遍较高。宁夏地区养牛在我国发展较早，国内外畜牧交易多，加之该地区全年干旱，对于奶牛和肉牛养殖产业发展有着得天独厚的优势。未免疫牛群的血清阳性率存在着地区性的差异，说明牛群的生长环境也是导致牛感染病毒性腹泻的原因之一。本次研究结果表明，清除PI 牛有助于牧场从根本上预防BVD的大规模感染。进行PI牛检测之后，对PI阳性犊牛的姐姐、妈妈进行了跟踪调查，结果发现犊牛的妈妈和姐姐抗原检测阴性，抗体检测阳性，说明犊牛的抵抗力相对较差，容易感染疾病，造成发病。关于相关传播机制还需要进一步研究。本次的研究为以后BVD的防控提供成功经验，要想彻底预防本病，还需要从生物安全的方面考虑，尽量减少外来病原的侵入，坚持自繁自养。

综上，从调查结果来看，规模化奶牛场病毒性腹泻的感染率普遍较高，BVDV的感染导致免疫力下降，进而引发其他传染病的发生，随着养殖生产的不断集中，规模化、现代化牧场的不断发展，疾病将会成为影响养殖业发展的决定因素。建立重大疾病预警体系，把疾病预防放在首位，是畜牧业发展的必然。从防控示范场的建设来看，清除PI牛是规模化牧场最经济的做法，也是减少规模化牧场疫病泛滥最为有效的方法。