新疆部分地区牛病毒性腹泻的流行病学调查

魏其，屈勇刚*，常军帅，谷思颖，吴圆圆，于会举，李静，张家瑞，肖陈城*，李岩

(1. 石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000；2. 新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站，新疆 乌鲁木齐 830063)

牛病毒性腹泻(bovine viral diarrhea,BVD)又称牛病毒性腹泻/黏膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease,BVD/MD)，是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)感染引起的一种接触性传染病，可造成牛感染严重的消化系统、生殖系统、呼吸系统疾病及免疫抑制等[1-3]。Olafson等[4]在美国首次报道BVDV在牛肠道及排泄物中被检测出，并称该病的典型特征为腹泻。1953年，美国衣阿华州在感染牛首次检测到BVDV，该病牛的主要临床表现为胃肠道黏膜溃疡[5]。随后该病在多个国家和地区广泛流行，对牛养殖业造成了严重威胁。1980年李佑民等[6]首次在我国患病母牛及流产胎儿中检测到BVDV的存在，并分离到了一株BVDV的野毒株。随后在我国多个省份和地区陆续检测出BVDV的存在，青海、宁夏、新疆的流行病学研究表明西北地区牛群中存在很高的BVDV抗体阳性率[7-9]。

BVDV是一种单股正链RNA病毒，其整个基因组由3′UTR、ORF编码区和5′UTR共同组成的一个大的开放阅读框，能编码所有的病毒蛋白。根据抗原性的不同和5′UTR的高度保守性，BVDV可分为2种基因型BVDV1和BVDV2。近年来，巴西、欧洲等发现BVDV3 型，但我国没有BVDV3型感染牛的相关报道[10]。我国2005至2013年主要分离鉴定出BVDV1型324株，其中BVDV1b和BVDV1m亚型毒株最多；鉴定出BVDV2型3株，主要为BVDV2a和2b亚型[11]。王梦心等[12]对在黑龙江省采集50份阳性病料进行BVDV分型发现所有毒株均属于BVDV1型，其中BVDV1b亚型占比最高为50.00%。随后马振国等[13]对新疆地区牛群进行调查，发现平均抗体阳性率为52.03%，抗原阳性率高达70.00%，主要流行的毒株基因型是BVDV-1q。BVDV在我国多个省份或地区已普遍存在，其中BVDV1型毒株最为流行，且在新疆地区的感染程度也相当严重。因此为了调查BVDV对新疆地区牛群的感染情况，本研究应用RT-PCR的方法对采自新疆部分地区的640份牛全血样品进行BVDV的检测及基因分析，以了解新疆地区BVDV的流行现状及主要流行毒株，进一步为新疆地区牛BVD的防控措施及净化工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

样品采集于2019年新疆具有代表性的13个地区(阿克苏、巴州、喀什、伊犁、石河子、昌吉、阿勒泰、博州、塔城、哈密、和田、奎屯、乌鲁木齐)的规模化牛养殖场，石河子地区采集样品160份，其余各地区采集样品均为40份，共采集牛全血640份，其中有120份样品采自石河子地区某规模化奶牛场不同年龄段的牛群，于-80 ℃温度下保存备用。

1.2 主要试剂

pEASY-T1 Simpie Cloning Kit、Trans1-T1感受态细胞、TransScript®All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for PCR(购自北京全式金生物技术有限公司)，TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0(购自宝生物工程大连有限公司)，FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、2×Taq Plus Master Mix、DL-2 000 Marker(购自南京诺唯赞生物科技有限公司)。

1.3 病毒总RNA的提取及反转录

取200 μL的病毒血液，参照TAKARA DNA/总RNA提试剂盒说明书提取病毒基因组总RNA。根据反转录试剂盒说明书进行操作，反应体系及反应条件如下：总RNA 4 μL为模板，加入RNase-free Water 12 μL混匀后，65 ℃孵育5 min，冰浴2 min后，加入5×TransScript®All-in-One SuperMix for PCR 4 μL，42 ℃孵育30 min，85 ℃热激5 s，置于-20 ℃保存备用。

1.4 引物合成与检测

根据参考文献[10]合成BVDV-F/BVDV-R，引物由华大基因合成，引物序列及片段长度如表1，送至华大基因进行测序拼接，其扩增目的片段大小为288 bp。对采集样品进行检测，PCR反应体系为：2×Taq Plus Master Mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O补足至20 μL。PCR扩增程序:94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。取PCR产物7 μL经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，将相应大小条带的胶切下，使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit进行胶回收纯化，按照说明书操作，回收产物于-20 ℃保存，备用。

表1 BVDV引物序列及扩增片段大小

1.5 PCR回收产物的克隆及测序分析

将PCR的回收产物按照pEASY-T1 Simpie Cloning Kit说明书连接到T载体上，再将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中，挑取单个菌落摇菌并进行PCR鉴定，反应体系及条件同RT-PCR方法。对鉴定结果为阳性的菌液送北京睿博兴科生物有限公司进行测序。使用DNAMan、MegAlign和MEGA 6.06软件进行序列分析，序列比对用clustal W算法，构建系统发育树用neighbor-joining方法。与国内外BVDV序列比对，所有参照序列的BVDV基因组从NCBI基因库下载。

2 结果与分析

2.1 BVDV目的基因RT-PCR扩增

对采集的13个地区规模化养牛场640份牛全血样品进行基因检测，凝胶电泳结果表明，阳性条带大小与预期目的片段大小一致(288 bp)，结果见图1。

M.DL2000 DNA Marker；1～8. 牛全血样品；N.阴性对照；P.阳性对照

此次研究共检测出BVDV阳性样品256份，平均总阳性率为40.0%(256/640)。各地区均检测到BVDV的存在，检出率为22.5%～62.5%；奎屯地区最高，为62.5%；喀什地区与博州地区最低，均为22.5%。检测结果见表2。

表2 不同地区BVDV检测结果统计表

不同年龄段牛群感染BVDV的平均阳性率为22.5%(27/120)，其中经产母牛的阳性率最高，为50.0%(6/12)，5月龄与6月龄牛未检出阳性，均为0.0%(0/12)，如表3。

表3 不同年龄段牛BVDV检测结果

2.2 BVDV 序列的测定与分析

测序结果表明，样品基因片段大小为288 bp。运用DNAMan、MegAlign软件和NCBI,将本研究得到的5株BVDV核苷酸序列与国内外17株BVDV基因序列进行同源性比较，发现获得的5株BVDV核苷酸序列之间有较高的同源性为98.3%～99.7%，其中ChangJ-12和KT-02同源性最高为99.7%；SHZ-06和ALT-05同源性最低为98.3%。与国内外BVDV1型毒株的同源性78.6%～98.2%，其中与中国毒株BVDV1a亚型的同源性最高为98.2%，与中国毒株BVDV1u亚型的同源性最低为78.6%；与国内BVDV2型毒株的同源性77.1%～77.4%；与国外BVDV3型毒株的同源性71.2%～74.3%，见图2。

图2 BVDV核苷酸序列的同源性分析

运用 MEGA 6.0软件将本研究所获得的5株BVDV基因核苷酸序列与国内外17株BVDV基因序列共同建立遗传进化树，见图3。根据遗传演化分析可知，本研究获得的ChangJ-12、KT-02、SHZ-06、ALT-05、AKS-2处在同一分支，与中国株BVDV1a亚型归为同一簇，遗传关系较为接近，但与BVDV2型、BVDV3型的遗传关系较远。

注：●为本研究所获得的BVDV核苷酸序列

3 讨论

BVD可使动物发生免疫抑制，免疫抑制和持续性感染是疫病长期传播的主要原因，给养牛业带来巨大的经济损失[14]，因此筛选BVDV阳性牛刻不容缓。BVDV检测方法有病毒分离、RT-PCR、免疫荧光技术和核酸杂交技术等[15]。刘崇向等[16]首次在新疆检测到BVDV的存在，通过免疫电泳和琼扩反应进行检测，抗体阳性率高达79.50%。随后在新疆其他地区也陆续检测出BVDV的存在，如王青青等[17]在2015至2016年新疆南疆地区30份疑似的样品中检测出2份阳性样品，阳性感染率为6.67%。王竞晗等[18]对2014年购买的一批进口胎牛血清，进行BVDV的分离及鉴定，得到一株BVDV 1a亚型病毒，说明市场上的牛血清有部分存在 BVDV污染。

本研究采用RT-PCR的方法对选取新疆具有代表性的13个地区的牛养殖场，共640份牛全血进行BVD流行状况调查，在13个地区均检测出BVDV阳性样品，平均阳性率为40.0%(256/640)，各地区检出率为22.5%～62.5%，其中奎屯地区最高，为62.5%，喀什地区与博州地区最低，均为22.5%，表明BVDV已在新疆广泛存在。BVDV极易通过排毒期病牛的尿液、口鼻分泌物、排泄物或羊膜液污染饲料等进行扩散，污染物使病毒能够间接地从动物向动物、从畜群向畜群传播。胎儿的感染由母体的垂直传播以及带毒的精液导致[19]。本研究在不同年龄段的经产母牛与10日龄犊牛中均检测出BVDV，但未表现出明显的临床症状，其中经产母牛与10日龄牛之间为一一对应关系，反映了BVDV存在的垂直传播方式，这与前人研究具有相似性。从不同生长阶段可以看出，在一岁、两岁和经产牛中该病毒的阳性感染率呈上升趋势，推测因配种等外界原因加大了感染该病毒的可能性，但因本研究采集的样本有限，为证实这一点还需进一步研究。

本研究得到的5株BVDV核苷酸序列，与国内外BVDV1型毒株的同源性78.6%～98.2%，其中与中国毒株BVDV1a亚型的同源性最高为98.2%；与国内BVDV2型毒株的同源性77.1%～77.4%；与国外BVDV3型毒株的同源性71.2%～74.3%。通过建立遗传进化树，对遗传进化分析可知，本研究获得的毒株处在同一分支，与中国株BVDV1a亚型归为同一簇，遗传关系较为接近，但与BVDV2型、BVDV3型的遗传关系较远。