两种驱虫方式对阿勒泰羊繁殖母羊体内外寄生虫的驱虫效果及驱虫后对肠道菌群的影响

钟池，李鑫，舒展，陈卓，冯雷喜、马义诚，赵红琼，郝智慧，姚刚*

(1. 新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2. 新疆阿勒泰地区动物疾控中心，新疆 阿勒泰 836500；3. 中国农业大学动物医学学院，北京 100000)

家畜寄生虫病是危害畜牧业生产的重要疾病。家畜寄生虫病在防治上主要采用药浴、投喂驱虫药、体表浇泼、注射等方式驱除体内外寄生虫[1]。伊维菌素是一种广谱、高效、低毒的抗寄生虫药物，对体内线虫和体外节肢动物均有驱虫活性，现已开发出多种兽医临床使用的制剂产品如注射剂、浇泼剂等，并广泛用于防治多种动物的线虫病和节肢动物寄生虫病[2-3]。

人类和动物机体的肠道菌群(gut microbiota)与其宿主的健康关系密切，肠道菌群通过影响宿主的生长发育、生理功能、免疫和行为等来改变宿主的健康[4]。已有研究报道证明，寄生虫等环境因素可影响宿主的肠道菌群组成和结构，反之亦然[5]。Knutie[6]对寄生飞绒蝇(Philornisdownsi)的加拉帕戈斯嘲鸫(Galapagosmockingbirds)和达尔文雀(Darwin’sfinches)雏鸟肠道菌群组成结构进行了研究，发现飞绒蝇的寄生降低了加拉帕戈斯嘲鸫雏鸟的肠道菌群的生境内多样性。给新生工蜂感染Lotmariapassim原虫后导致其肠道核心菌群组成发育不全[7]。Gilchrist等[8]研究发现，人体溶组织菌阿米巴(Entamoebiasishistolytica)感染后，腹泻症状的发生与寄生虫侵害加重和粪普氏菌(Prevotellacopri)的增加有关[8]。被线虫感染的兔和被鞭虫感染的小鼠，在感染急性期的肠道菌群 Alpha 多样性显著减少[9-11]。在灵长动物中，肠道寄生虫(线虫和美洲钩虫)的自然或实验性感染使肠道菌群的 Alpha 多样性普遍增加[12-14]。但郭歆岩[15]研究表明，肠道菌群的 Alpha 多样性在寄生虫感染后没有改变。因此，肠道内寄生虫和与之共生的庞大肠道菌群可能有着错综复杂的关系，值得深入研究。对不同驱虫剂型作用下，肠道菌群结构是否会发生改变尚未有明确报道。本试验采用伊维菌素浇泼剂和注射剂作为驱虫药，使用浇泼和注射两种驱虫方式对绵羊进行的驱虫效果试验，同时对两种驱虫方式作用下的肠道菌群结构的变化进行研究，探索两种伊维菌素剂型是否会对肠道菌群结构有影响，也籍此对两种伊维菌素驱虫剂的安全性提供胃肠功能方面的间接支持。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组

取自阿勒泰地区某肉羊养殖合作社放牧加补饲的健康母羊75只，年龄为4～5岁，体重为(50.96±7.27)kg。

1.2 药品与试剂

0.5%伊维菌素浇泼剂，1 mL含伊维菌素5 mg，每瓶 200 mL装，中国农业大学动物医学院提供。主要成分为伊维菌素，药物批号为20191216。

1%伊维菌素注射剂，1 mL含伊维菌素10 mg，每瓶200 mL装，中国农业大学动物医学院提供，药物批号为20191220。

粪便DNA提取试剂盒(Stool Genomic DNA Kit，50 preps)，货号CW2092，生产日期为2018年9月，购自康为世纪生物科技有限公司。

1.3 试验设计与分组处理

通过筛选的阿勒泰大尾羊75只，随机分为3组，注射驱虫组、浇泼驱虫组和不驱虫对照组，每组25只。不驱虫对照组(Ctr)不进行用药；注射驱虫组(Inj)剂量按 0.02 mL/kg，皮下一次注射给药；浇泼驱虫组(Spi)剂量按 0.1 mL/kg，羊背部浇泼一次给药。分别于用药前(第0天)和用药后(第21天)观察检查体表寄生虫，测定羊体温、呼吸、脉搏等生命体征，并采集粪便。粪便采集2份，分别用于观察体内虫卵(低温保存)和高通量测序(采集的粪便液氮速冻带回实验室保存)。

1.4 指标测定

1.4.1 生理指标测定

体温测定：采用电子数字温度计将温度计置于羊后肢股内侧并读数，或者兽用红外测温仪测量，兽用红外线测温仪测定羊的体温3～5 s，测3次取平均值；

呼吸测定：通过观察羊胸腹部的起伏动作测定，秒表记录每分钟呼吸次数；

脉搏测定：通过触压后肢股内侧部股动脉，秒表记录每分钟脉次数。

呼吸、脉搏秒表计数15 s，测定3次，取平均值，算出每分钟呼吸、脉搏数。

1.4.2 体表寄生虫检查

疥螨、痒螨和蜱虫的采样方法参照文献[16]进行采集，检查方法参照文献[17]进行。虱子的采样和检查鉴定方法参照文献[18]进行。

1.4.3 体内线虫卵检查

采用麦克马斯特氏法进行虫卵计数。按照杨希菊[19]的方法制备饱和盐水 (100 mL水加食盐 35～40 g) 1 L于锥形瓶中，从粪便不同的部位挑起 2 g的粪便块，加入饱和盐水 58 mL，将粪便充分震荡捣碎，与盐水搅匀，使成均匀粪液[19]。用吸管吸取粪汁注入麦氏计数室中，静置 1～2 min，然后再镜下计数 1 cm2方格内的虫卵总数，求出两个刻度室中的虫卵平均数，乘以200即为每克粪便虫卵数(EPG)。

1.4.4 肠道菌群结构分析

用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便样品中DNA，操作步骤按照说明书和文献[20]等所述方法进行。

采用16S rDNA序列扩增、测序、分析。测序分析由深圳微生太科技有限公司完成。按照流程操作准备样品，提取粪便DNA，然后进行PCR扩增。以能够反映菌群组成和多样性的目标序列为靶点，根据序列中的保守区域设计相应引物，并在添加测序时区分不同样本的标签序列(Barcode)，进而对rRNA基因可变区(单个或连续的多个)或特定基因片段进行PCR扩增。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库。最后上机进行高通量测序，由于MiSeq测序读长较短的特性，同时也为了保证测序质量，设定目标片段的测序长度为 200～450 bp。

1.5 数据处理

对肠道菌群物种操作分类单元(Operational taxonomic unit，OTU)进行丰度、维恩(Venn)图、Alpha多样性、Beta多样性等分析。所测数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用统计分析软件GraphPad Prism 8.0.1进行单因素方差分析，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 体内外驱虫情况

在驱虫第0天和驱虫第21天，对各试验组羊体表寄生虫和体内虫卵统计计数。结果表明，经注射、浇泼方式驱虫后对体内线虫卵、体外寄生虫总数较驱虫前具有极显著差异(P<0.01)，驱虫效果明显(表1)。

表1 各试验组羊在使用药物前后体外寄生虫总数和体内虫卵情况统计

2.2 生理指标测定结果

对各试验组羊的体温、呼吸和脉博次数测定结果如表2所示。2个驱虫组与对照组间体温、呼吸和脉搏数值均无显著差异(P>0.05)。

表2 各试验组羊生命体征测定结果

2.3 肠道菌群测定结果

2.3.1 肠道微生物物种组成分析

2.3.1.1 肠道菌群OTU组成Venn分析

基于肠道菌群物种操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU)进行Venn法初步分析，结果如图1所示。Ctr、Inj和Spi 3组共有的OTU为42个，Ctr组特有OTU为517个，Inj组特有OTU为561个，Spi组特有OTU为655个(图1)。

图1 各组羊肠道微生物共有OTUs的数量Venn图

2.3.1.2 差异物种Lefse分析

根据差异物种Lefse分析，结果发现梭菌科(Clostridiaceae)和梭菌属(Clostridium)为Ctr组绵羊肠道菌群的差异表达特征菌属。Ctr组中该菌属平均相对丰度为0.01%，而经Inj和Spi方法驱虫处理后，肠道菌群中没有检测到梭菌科(Clostridiaceae)和梭菌属(Clostridium)的菌属存在(图2)。LDA值分布柱状图(显著差异物种影响程度)显示出梭菌科、梭菌属为Ctr组的差异物种。

图2 LEfSe分析进化分支图和差异物种影响

2.3.1.3 门和属水平菌群丰度及物种组成

在3个试验组羊的肠道菌群门水平上，共检出15个菌门，如图3A所示。相对丰度大于等于0.1% 的菌门有8个，这8个门水平的细菌是这3个组羊中的核心菌群。相对丰度大于等于10% 的菌门有2个，它们分别为拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)，是这3个组羊的优势菌群。将2个驱虫组与不驱虫的对照组比较，结果见表3。3个试验组门水平OTU相对丰度无显著差异(P>0.05)。

注：未译中文的英文菌名，暂无合适中文译名

表3 各组羊肠道菌群中相对丰度最高的15个门

在肠道菌群属水平上，共检出92个菌属，并对前20的菌属(共包含了90% 以上的相对丰度)进行了统计制图(图3B)。在图3B中大于10% 的2个菌属分别为疣微菌科未明确分类的属(Unspecified_Ruminococcaceae)和拟杆菌目未明确分类的属(Unspecified_Bacteroidales)，它们是3个试验组羊的优势菌群。将不同驱虫方式的2个组与不驱虫对照组比较，结果显示(表4)，属水平OTU相对丰度无显著差异(P>0.05)。

表4 各组羊肠道菌群中相对丰度最高的20个属

2.3.2 Alpha多样性分析

如表5所示，注射驱虫组、浇泼驱虫组观测到的群落丰富度指数(Chao1)、群落多样性指数(Shannon)和系统发育多样性指数(Faith’s_pd)，均无显著差异(P>0.05)。

表5 Alpha多样性指数分析

2.3.3 Beta多样性

通过不同样品间的微生物群落构成进行比较，主坐标分析(PCoA)显示，不同驱虫模式下的样品聚集在一起，微生物群落结构相似度高(图4A)。非度量多维尺度分析(NMDS)中样本间距离与主坐标分析结果类似，微生物群落结构相似度高(图4B)。Permanova检验分析表明(表6)，不同驱虫模式作用下菌群结构无显著差(P>0.05)。

注：括号中百分比表示对应坐标轴所解释的样本差异数据比例

表6 Permanova检验

3 讨论

本次驱虫试验采用了伊维菌素注射和浇泼两种驱虫方式，均对绵羊的体外寄生虫驱虫效果明显。消化道虫卵检测结果也表明，两种方式对体内寄生虫虫卵数也有一定的驱除作用。本试验与王文龙等[21]的浇泼、注射方法一样，结果也一致；同时与魏彩艳[22]伊维菌素浇泼结果也一致。

人和动物的肠道内有数以万计的微生物，包括细菌、古生菌、病毒和真菌等，其中数量最多的是细菌。这些微生物与宿主共代谢、共进化，形成互惠共利的复杂关系。肠道菌群能为机体提供营养和能量、调节免疫、颉抗病原微生物、参与代谢，甚至能影响宿主的行为[23-24]。机体的肠道菌群受遗传因素、饮食和环境(如使用驱虫药)等多因素的影响。这种共生关系可能会因为疾病而被破坏，诸如寄生虫感染能够影响宿主肠道菌群组成，进而影响宿主健康；而肠道菌群也能够影响寄生虫的活力与感染力[25]。有研究表明在肠道微生物与寄生虫相互作用，肠道菌群的稳定是宿主健康的关键因素之一[26]。Coyte等[27]发现，蛔虫的感染会对宿主造成严重的营养不良，损害了宿主的认知、记忆等功能，同时也引起肠道菌群发生变化，与感染寄生虫的粪样相比较，未感染寄生虫的粪样显示出肠道菌群物种的丰度更高。寄生虫和肠道菌群间的作用是相互的，通过改变肠道菌群的组成可能增加黏膜部位对寄生虫感染的抵抗力，并提升宿主对这些寄生虫的全身免疫能力[28]。分析人类感染寄生虫过程中肠道微生物的特定成分中发现，双歧杆菌(Bifidobacterium)和链球菌(Streptococcus)丰度较高的宿主对恶性疟原虫的抗感染能力更高[29]。在胃肠道寄生虫入侵后，急性发作的炎症是伴随着初始肠道菌群Alpha多样性减少，并且随着慢性感染的建立而恢复[30-31]。

目前研究表明，抗生素药物大量应用于多种疾病的治疗，同时可能会导致肠道微生物群生态失调，多样性发生改变等[32]。试验证实小鼠饲喂万古霉素、新霉素等抗生素后肠道菌群结构发生改变，多样性指数(Chao 1，Shannon，Simpson)均显著下降[33]。本试验肠道菌群测定结果表明，经两种驱虫方法处理后，绵羊肠道菌群结构整体没有被影响，不同驱虫方式属水平OTU相对丰度无显著差异，Alpha多样性分析显示均无显著差异，Beta多样性分析显示，不同驱虫模式作用下菌群结构无显著差异。这可能与本文试验所用药物与前述研究不同、给药方式不同和用药浓度较低，浇泼和注射给药并未直接接触动物消化道等因素有关。另外，郑舟琴等[34]在分析抗生素对小鼠糖代谢及肠道菌群的影响试验中，每周对小鼠粪便做16S rDNA基因测序分析，发现抗生素组较对照组肠道菌群Shannon指数显著下降。万有娣等[33]在试验中发现，其中一组感染第9天时，小鼠肠道菌群和微生物代谢已基本恢复。而本试验结果的观察测定时间为驱虫后第21天，显著长于上述文献的第9天，也可能是未发现肠道菌群结构显著变化的另一个原因。

梭菌属是一群革兰阳性菌，能产生芽胞，对外界抵抗力强。其广泛分布于环境、人和动物肠道中，该属中有许多种可产生外毒素的致病菌，对人和动物产生危害，其常见致病厌氧芽胞梭菌主要有破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌和艰难梭菌(Clostridiumdifficile)等。研究表明，纤维摄入量过低均可能形成有利于梭状芽胞杆菌生长的肠道环境，从而增加梭状芽孢杆菌感染导致结直肠癌发生的风险[35-36]。调节肠道的微生物群的平衡，可以抑制梭状芽孢杆菌的生长，从而达到降低结直肠癌风险[37]。本试验根据物种差异Lefse分析发现，梭菌科和梭状属为不驱虫对照组中的优势差异菌属，显著高于经两种驱虫方式驱虫的给药组。两种驱虫方式降低了梭菌科和梭状属的相对丰度可能对于其肠道菌群结构的改善有益。

本试验采用伊维菌素的两种剂型的驱虫方式均显示良好效果，且对出宿主肠道菌群整体组成结构几无影响，而梭菌科、梭菌属相对丰度的显著下降可能对动物健康有益。两种驱虫方式未对绵羊正常生理功能造成不利影响，也间接支持其安全性较好。