Musashi-1下调在抑制神经胶质瘤细胞恶性表型中的意义

毛中臣 孙永 赵燕 陈卡佳 付志新 (开封市中心医院神内重症，河南 开封 475000)

神经胶质瘤(胶质瘤)是起源于中枢神经系统的恶性肿瘤，占颅内原发肿瘤的50%，手术治疗、放射治疗、化学治疗等是目前胶质瘤治疗的主要途径，随着胶质瘤发病机制研究的不断深入，寻找有效的靶基因治疗胶质瘤是研究的重点〔1〕。Musashi-1参与细胞的自我更新和分化过程，其是一个进化极为保守的RNA结合蛋白。研究显示Musashi-1可能是一种致癌基因，能够刺激肿瘤细胞的生长，增加肿瘤细胞致瘤能力〔2〕。对结肠癌和肺腺癌的体外研究显示，Musashi-1下调可以诱导肿瘤细胞的凋亡〔3～5〕。本实验通过构建下调Musashi-1的胶质瘤细胞，探讨其在胶质瘤细胞凋亡、侵袭等中的作用，为靶向Musashi-1治疗胶质瘤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料 胶质瘤细胞U251和U87为赛业(苏州)生物公司产品。细胞于含有10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中培养。

兔抗活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cleaved caspase)-3抗体、兔抗基质金属蛋白酶(MMP)-9抗体、兔抗波形蛋白(vimentin)抗体为美国R&D Systems公司产品；兔抗MMP-2抗体、兔抗上皮性钙黏附素(E-cadherin)抗体为美国Santa Cruz公司产品；Musashi-1 siRNA慢病毒和阴性对照慢病毒载体由深圳中洪博元生物公司构建；Musashi-1为美国Abcam公司产品；Realtime PCR试剂为德国QIAGEN公司产品；Line Gene 9600 Plus荧光定量PCR检测系统为杭州博日科技公司产品；Thermo Multiskan FC 酶标仪为美国Thermo产品；Biosciences FACSAria Ⅲ流式细胞仪为美国BD产品。

1.2方法

1.2.1慢病毒感染 胶质瘤细胞U251和U87培养至对数期以后，分别种植到6孔板中，细胞接种密度为5×105个/孔，细胞密度为40%时，进行感染。病毒感染复数(MOI)=20，向细胞中加入病毒液(病毒液滴度为1×108tu/ml)，同时在细胞中添加聚凝胺(polyberne)，polyberne终浓度为5 μg/ml。培养8 h后，观察细胞生长状态，把原来的培养液吸弃，加入新鲜的细胞培养液，继续培养3 d以后，用1 μg/ml的嘌呤霉素筛选，筛选稳定感染的细胞株用Realtime PCR和Western印迹检测干扰效果。

1.2.2实验分组 把感染Musashi-1 siRNA慢病毒后的细胞记为si-Musashi-1组，把感染阴性对照慢病毒后的细胞记为si-NC组。把没有感染的细胞记为Control组。

1.2.3Realtime PCR测定干扰效果 Control组、si-NC组、si-Musashi-1组细胞中添加Trizol(每个25 mm2的培养瓶中加入1 ml的Trizol)，将细胞置于冰上混合裂解以后，在裂解液中添加200 μl三氯甲烷溶液，并置于室温条件孵育3 min，在4℃，10 000 r/min离心10 min后，吸取上层溶液约500 μl(RNA存在上层水相中)。添加等体积的异丙醇后，放在4℃条件下结合孵育30 min。离心后，添加75%乙醇将沉淀的RNA洗涤后，在室温中干燥，添加焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，保存至-70℃。按照逆转录合成试剂盒合成cDNA，设置逆转录条件为37℃ 15 min、85℃ 5 s，4℃ 10 min。再进行Realtime PCR，PCR的程序为：95℃ 15 s；58℃ 60 s，一共40个循环。PCR结束后，用2-△△Ct方法计算目的基因Musashi-1的mRNA表达情况，以β-actin作为内参。引物由南京金斯瑞合成。Musashi-1的上游引物序列为5′-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3′，下游引物序列为5′-GTAATACGGT TATCCACGCG-3′；β-actin的上游引物序列为5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′，下游引物序列为5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′。

1.2.4Western印迹测定干扰效果 向Control、si-NC、si-Musashi-1各组细胞中添加裂解液，并放置在冰上反应20 min，4℃，10 000 r/min高速离心。蛋白样品与等体积的上样缓冲液中混合后，煮沸5 min。按照每个泳道加入40 μg蛋白样品，浓缩胶中80 V电压，分离胶中100 V电压进行电泳。电泳结束后，进行转膜，转膜置于4℃中进行，转膜电流设置为200 mA，转膜时长为2 h。取出转膜后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，置于封闭液(5%脱脂奶)中室温孵育2 h，用TBST洗涤后，再将PVDF膜放在1∶200稀释的抗Musashi-1抗体中室温孵育2 h。PVDF膜经TBST洗涤后，置于1∶5 000稀释的Ⅱ抗中室温结合2 h。用电化学发光(ECL)试剂盒显色以后，以软件Image J分析灰度值，以每组的β-actin灰度值为内参，分析并计算Musashi-1/β-actin灰度值的比值，以此比值作为Musashi-1的蛋白表达水平。

1.2.5噻唑蓝(MTT)检测细胞活力 Control、si-NC、si-Musashi-1各组细胞用细胞培养液悬浮，制成浓度为4×104个/ml的单细胞悬浮液，每个孔中加入100 μl种植到96孔板内，把培养板置于37℃，5% CO2培养箱内，分别在24 h、48 h、72 h、96 h取出培养板，每组设置4个复孔，添加10 μl的MTT溶液(浓度为5 mg/ml)显色以后，加入二甲基亚砜(DMSO)孵育10 min。置于酶联免疫吸附试验检测仪上检测492 nm波长处的吸光度(A值)，以空白孔调零 。

1.2.6流式细胞术检测细胞凋亡 Control、si-NC、si-Musashi-1各组细胞用0.25%的胰蛋白酶常规消化后，用磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞悬浮，制成浓度为1×106个/ml的细胞悬浮液。吸取1 ml的细胞悬浮液至5 ml的培养管内，加入膜联蛋白(Annexin)V-FITC和碘化丙啶(PI)染液，在避光条件下孵育15 min。添加400 μl的结合缓冲液混合以后，上流式细胞仪检测。

1.2.7划痕愈合实验检测细胞迁移 Control、si-NC、si-Musashi-1各组细胞用0.25%的胰蛋白酶常规消化后，用细胞培养液将细胞悬浮，制成浓度为1×104个/ml的细胞悬浮液，种植到培养瓶中，细胞密度为80%时，在细胞中划出一条划痕，继续置于37℃，5% CO2培养箱培养24 h。分别测定0 h和24 h时划痕的宽度，计算细胞迁移率变化。细胞迁移率=100%×(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度。

1.2.8Transwell小室检测细胞侵袭 基质胶湿化transwell小室2 h。Control、si-NC、si-Musashi-1各组细胞用不含血清的培养液悬浮以后，在上室中添加200 μl的细胞悬浮液(约含有105个细胞)，在下室内加入600 μl的含血清的细胞培养液。24 h后取出transwell小室，用棉签将小室内没有穿膜的细胞擦掉，4%多聚甲醛固定后，用结晶紫染色。显微镜下选取至少5个视野观察细胞侵袭数目。

1.2.9Western印迹检测细胞中cleaved caspase-3、MMP-2、MMP-9、E-cadherin、vimentin蛋白水平 取Control、si-NC、si-Musashi-1各组细胞，用Western印迹方法检测细胞中cleaved caspase-3(抗体以1∶100稀释)、MMP-2(抗体以1∶400稀释)、MMP-9(抗体以1∶400稀释)、E-cadherin(抗体以1∶600稀释)、vimentin(抗体以1∶600稀释)蛋白水平，步骤同1.2.4。

1.3统计学分析 采用SPSS21.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2 结 果

2.1Musashi-1 siRNA慢病毒下调胶质瘤U251和U87细胞中Musashi-1的表达 胶质瘤U251和U87细胞感染Musashi-1 siRNA慢病毒后，细胞中的Musashi-1蛋白和mRNA水平均降低，说明成功构建了下调Musashi-1的胶质瘤细胞。见表1、图1、图2。

图1 Western印迹检测U251细胞Musashi-1蛋白表达

图2 Western印迹检测U87细胞Musashi-1蛋白表达

表1 下调Musashi-1后的胶质瘤细胞中Musashi-1 mRNA和蛋白表达水平比较

2.2下调Musashi-1降低胶质瘤U251和U87细胞活力 下调Musashi-1后的胶质瘤细胞A值明显降低，说明下调Musashi-1降低胶质瘤细胞活力。见表2。

表2 敲减Musashi-1表达后胶质瘤U251和U87细胞A值的比较

2.3敲减Musashi-1表达诱导胶质瘤U251和U87细胞凋亡 敲减Musashi-1表达后胶质瘤细胞的凋亡率和细胞中cleaved caspase-3的蛋白水平显著升高(P<0.05)，说明下调Musashi-1可在体外诱导胶质瘤细胞凋亡。见表3、图3～5。

表3 下调Musashi-1后胶质瘤细胞凋亡率和cleaved caspase-3水平比较

图3 流式细胞术检测细胞凋亡

图4 Western印迹检测U251细胞cleaved caspase-3蛋白表达

图5 Western印迹检测U87细胞中cleaved caspase-3蛋白表达

2.4下调Musashi-1抑制胶质瘤U251和U87细胞侵袭和迁移 下调Musashi-1后的胶质瘤细胞侵袭数目及迁移率均显著降低，胶质瘤细胞中的MMP-2和MMP-9蛋白表达均显著减少(P<0.05)，说明下调Musashi-1抑制胶质瘤细胞侵袭和迁移能力。见表4、图6、图7。

表4 下调Musashi-1后胶质瘤U251和U87细胞迁移率、侵袭数目和MMP-2、MMP-9蛋白水平比较

图6 Western印迹检测U251细胞中MMP-2、MMP-9蛋白表达

图7 Western印迹检测U87细胞中MMP-2、MMP-9蛋白

2.5下调Musashi-1抑制胶质瘤细胞上皮-间质转化(EMT) 下调Musashi-1后的胶质瘤细胞中E-cadherin表达水平显著升高，细胞中vimentin表达水平显著下降(P<0.05)，说明下调Musashi-1抑制胶质瘤细胞EMT。见图8、图9、表5。

图8 Western印迹检测U251细胞E-cadherin、vimentin蛋白表达

图9 Western印迹检测U87细胞E-cadherin、vimentin蛋白表达

表5 下调Musashi-1后的胶质瘤细胞中E-cadherin、vimentin蛋白表达水平比较

3 讨 论

基因转录后调控与RNA结合蛋白有关，在人类的体内已经发现有800多种的RNA结合蛋白，在这些RNA结合蛋白中有的与转录因子功能相似，参与癌变过程，在肿瘤发生中具有促进或者抑制作用〔6〕。Musashi-1属于RNA结合蛋白，具有维持自我更新和分化等的作用，是多种细胞的干细胞标志物，是结肠癌等多种癌症发生的调节剂〔7〕。人类的Musashi-1基因含有两个RNA结构域，这两个结构域中含有α-螺旋和β折叠，能够与目的RNA结合，参与基因的表达调控过程〔8〕。很多研究显示，Musashi-1在肿瘤中表达上调，例如肝细胞肝癌、结肠癌、胶质瘤等，沉默其表达可以抑制结肠癌、肝癌等癌细胞的生长，其在肿瘤细胞生长中发挥促进作用〔9～11〕。本实验表明，下调Musashi-1后胶质瘤细胞活力降低，说明Musashi-1在胶质瘤中可能发挥癌基因的作用。

肿瘤细胞凋亡减少肿瘤发生的重要原因之一，其受到细胞内Caspase蛋白家族成员的调控，Caspase蛋白家族也是目前为止研究最为透彻的细胞凋亡调控因子，其蛋白成员活化后可以诱导细胞凋亡的发生〔12〕。Caspase蛋白家族包括10个以上的蛋白成员，这些蛋白成员在活化之前没有促凋亡作用，只有受到凋亡信号刺激以后可以诱导细胞凋亡的发生，Caspase-3是凋亡发生的下游执行子，其活化水平升高后是不可逆细胞凋亡发生的标志〔13〕。本实验的结果表明，下调Musashi-1后胶质瘤细胞凋亡水平升高，细胞中Caspase-3活化水平升高，提示下调Musashi-1具有激活Caspase级联反应诱导细胞凋亡发生的作用。

EMT是肿瘤细胞迁移和侵袭的早期标志，EMT发生促进肿瘤细胞与相邻细胞分开，其上皮标志物E-cadherin等表达水平下调，间质标志物vimentin等表达水平升高〔14〕。MMP-2和MMP-9均属于MMPs成员，二者在肿瘤转移中发挥促进作用〔15〕。在肝癌中的研究显示，过表达Musashi-1后的肿瘤细胞侵袭能力增加，下调Musashi-1可以下调癌细胞的迁移能力〔16〕。本实验显示，下调Musashi-1后的胶质瘤细胞24 h的迁移、侵袭能力降低，细胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平下降，同时细胞间质标志物vimentin表达水平降低，上皮标志物E-cadherin表达水平升高，提示下调Musashi-1可能降低胶质瘤细胞EMT和侵袭迁移能力。

Musashi-1在胶质瘤中可能发挥促进作用，下调其表达后的胶质瘤细胞U251和U87活力、侵袭、迁移能力降低，细胞凋亡增多，而对于其具体的作用机制尚未研究。本实验结果明确了Musashi-1在胶质瘤细胞凋亡、侵袭等生物学特性发挥中的作用，这对于研究Musashi-1在胶质瘤发生中的作用机制具有重要意义，为靶向基因治疗胶质瘤提供了新思路。