福建省蛇舌形虫18S rRNA基因的扩增及虫种鉴定

宋肇程，黄潇航，夏锡锐，黄志坚，殷光文

(1.福建农林大学动物科学学院，福建 福州 350002；2.福建省动物药物工程实验室，福建 福州 350002；3.华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642)

本试验通过对福建省三明市的某蛇场得到的死亡病蛇进行剖检，观察其器官的病变，并从其肺脏采集到的1对虫体，初步怀疑为舌形虫病。之后对采集的虫体和肠道结节的18S rRNA基因序列进行PCR扩增、测序，并与NCBI数据库中的相应序列进行比较分析，从而对样品进行分子鉴定。为舌形虫的分子鉴定提供了科学根据，也为将来同类的研究提供借鉴、例证。

1 材料与方法

1.1 样品材料 样品为采自福建省三明市某蛇场1条病死蛇。

1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒FastDNA SPIN Kit、高保真酶TransStart®FastPfuFlyDNA Polymerase高保真DNA聚合酶、EasyTaqMix聚合酶、胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit、pEASY-Blunt Simple载体、Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞，均购自北京全式金生物技术有限公司。凝胶成像系统(Omega Fluor Plus蓝光凝胶成像系统)由Aplegen公司生产，PCR仪由基因有限公司生产。电泳系统由北京市六一仪器厂生产。

1.3 病变与病原观察 剖检眼镜蛇尸体，肉眼观察肺脏与肠道，检查是否发生病变、结节。检查病变器官是否存在寄生虫虫体，并进行观察。

1.4 样本DNA提取及PCR扩增目的片段 将虫体和肠道结节按FastDNA SPIN Kit试剂盒说明书所述方法，提取基因组DNA。采用引物(NEMF1：5′-CGCAAATTACCCACTCTC-3′；S3：5′-AGTCAAATTAAGCCGCAG-3′)、TransStart®FastPfuFlyDNA Polymerase扩增酶进行扩增，反应体系为50 μL体系(DNA模板6 μL，上下游引物各1 μL，TransStart FastPfu Fly 1 μL，DNA Buffer 10 μL，dNTPs 4 μL，ddH2O 27 μL)。PCR反应程序：95 ℃ 2 min；(95 ℃ 20 s；55 ℃ 20 s；72 ℃ 1 min)×30个循环；72 ℃ 5 min；扩增时设阴性对照。扩增结束后用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.5 PCR产物纯化、克隆及筛选 使用胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit，按照说明书进行PCR产物纯化。后连接于pEASY-Blunt Simple载体上转化至Trans I-T1感受态细胞中进行扩增，涂板培养过夜，挑取单个菌落培养，用EasyTaqMix和M13F/M13R引物进行PCR扩增后挑选出阳性菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.6 系统进化分析 将测序得到的基因序列与NCBI中公布的相关基因序列进行对比分析并绘制序列系统发生树。

2 结果

2.1 病变与病原观察 病蛇呼吸困难，有张口呼吸的情况，同时拒食。剖检病蛇尸体发现，病变部位主要集中在肺脏和肠道(见中插彩版图1)。在剖检时发现肺脏上有1对寄生虫虫体(见中插彩版图2)，虫体为蠕虫状，略呈圆柱形，细长，约有7.55～7.61 cm。颜色为乳白色略有发黄，半透明状。头尾较尖细，中间部位较粗，肉眼未见到明显的体环。体壁柔软，略有弹性。口器位于虫体头部，口周围有4个口钩，头胸部之间较细，可见1条贯穿于虫体的消化道，消化道内有黑色内容物。对肠道结节进行压片镜检发现存在有钩状结构的寄生虫(见中插彩版图3)。根据对病蛇器官组织病变以及虫体的观察，初步怀疑为舌形虫病。

2.2 基因片段的扩增结果与序列分析 以TransStartFastPfuFlyDNA Polymerase扩增酶，采用特异性引物(NEMF1，S3)对基因进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示基因片段均在750 bp左右(见图4)。

图4 舟山眼镜蛇舌形虫 18S rRNA基因序列PCR扩增产物电泳分析

试验筛选的阳性菌落经生工生物工程(上海)股份有限公司测序后得到舟山眼镜蛇肺部寄生虫成虫和肠道结节的18S rRNA序列，序列全长均为770 bp，与NCBI的Nucleotide BLAST公布的相关序列比较可知，其18S rRNA基因序列与GenBank中的EU370434.1(Raillietiellasp.1 BMR-2008 strain C129)；AY744887.1(Raillietiellasp.MCZ DNA101107)的舌形虫相似性为99.74%；与KC904945.1(Raillietiellaorientalis)的舌形虫相似性为97.40%；与JX088397.2(Linguatulaserrateisolate NoDog1)的相似性为93.51%。由此可证明，从福建舟山眼镜蛇中发现的舌形虫为Raillietiella属的寄生虫。

经GenBank检索10种有代表性的舌形虫、作为外群的一种阔节裂头绦虫的18S rRNA进行相似性分析。舌形虫序列的序列号分别为：EU370434.1、AY744887.1、AY304521.1、AY304520.1、KC904945.1、KU975377.1、KU975376.1、KU975375.1、KU975378.1、JX088397.2，阔节裂头绦虫序列号为：KF218251.1。使用DNASTAR 7.1软件的Megalign程序对以上序列进行比对，可以看出各个序列之间的相似性与差异性的百分比。此次分离到的成虫和肠道结节中的序列相似性为100%，与GenBank中舌形虫之间序列相似性在91.7%～99.6%；与阔节裂头绦虫Diphyllobothrium latum(序列号：KF218251.1)的相似性低于70.9%(见图5)。

图5 舟山眼镜蛇舌形虫与其他舌形虫基因序列相似性对比图

选取18S rRNA基因序列使用MEGA 7.0软件绘制序列系统发生树(见图6)。通过种系发育分析显示：福建舟山眼镜蛇肺部舌形虫18S rRNA基因序列与EU370434.1、AY744887.1和KC904945.1的亲缘关系比较近。与AY304521.1和AY304520.1同属于一个大的分支。与其他舌形虫的亲缘关系稍远。由此可确定该株为Raillietiella属的舌形虫。

图6 舟山眼镜蛇舌形虫18S rRNA基因序列系统发生树

3 讨论

舌形虫主要寄生蛇类等食肉爬行动物的呼吸系统中，也会感染蟾蜍、鸟类以及包括人类等在内的哺乳类动物[1-3]。人类舌形虫病主要经食物或水源传播，与终末宿主的密切接触也可能造成感染[4]。舌形虫病分为内脏型和鼻咽型2个型[5]，可以引起腹痛、腹泻、呕吐、肝肿大、黄疸以及肺叶空洞等[6-9]。除国内报道过的尖吻蝮、滑鼠蛇等和本实验室此次发现的舟山眼镜蛇外，在澳大利亚、巴西和北美等地也有蛇类舌形虫病的报道[10-11]。可见舌形虫已经存在较为广泛的分布。

本试验采用形态学和分子生物学的鉴定方法对舟山眼镜蛇的舌形虫进行了鉴定。利用高度保守的18S rRNA基因的特异性引物对舟山眼镜蛇的舌形虫虫体和蛇肠道结节的18S rRNA基因序列进行PCR扩增，测序。结果表明，该虫体为Raillietiella属的舌形虫。且试验结果显示，其18S rRNA基因序列种内差异小于种间差异，表明18S rRNA基因可以作为种间遗传标记来鉴定舌形虫。我们在舟山眼镜蛇的体腔中发现的这对成虫虫体和肠道结节的PCR和测序结果一致，说明肺脏和肠道具有同时寄生的情况。据Raillietiella舌形虫已有的生活史研究可知：虫卵被终末宿主排出，发育为感染性虫卵被中间宿主吞食，在中间宿主中发育为若虫，中间宿主被终末宿主吞食后，感染性若虫在其肠道内进行发育，从肠壁钻出经体腔移行至肺脏继续发育成成虫。这与本试验的结果相吻合。该养殖场用作饲料的蛙类和雏鸡都可作为中间宿主感染，并且场址地处山林，畜舍附近经常有野生的蛙类和鼠类出没，由此可以推测：养殖场的眼镜蛇还有误食感染了舌形虫的野生动物从而成为终末宿主的可能性。本试验成功确诊福建省三明市某蛇场的舟山眼镜蛇患有舌形虫病，为福建省舟山眼镜蛇舌形虫的分子生物学研究奠定了基础。此寄生虫对蛇类和人类都会造成严重危害，养殖蛇类尚且存在感染，意味着野生蛇类可能存在更加严重的感染。由此提醒相关人员做好防治工作以保证舟山眼镜蛇的生存质量。由于舌形虫的生物学分类的研究仍然存在着一定的争议，所以对于其物种的分类仍有待进一步探索。