我国牛羊蓝舌病血清学调查

朱 沛，肖 雷，苗海生，杨振兴，谢佳芮，朱建波，李华春

(云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室 , 云南 昆明 650224)

蓝舌病(Bluetongue,BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)引起的绵羊和其他家养及野生反刍动物的一种非接触性烈性传染病[1]。该病能引起发热、白细胞减少、发绀、鼻腔和胃肠道黏膜严重的卡他性炎症，并能引发妊娠母畜流产、死胎等，对养殖业造成重大损失[2]。该病致死率为20%～30%，有时甚至高达90%[3]，由于BT对畜牧业和畜产品经济贸易的影响以及对社会经济大环境的潜在威胁，世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,OIE)将蓝舌病列为法定上报的疫病，我国将其列为一类传染病[4-5]。

蓝舌病病毒为双链RNA病毒，属于呼肠孤类病毒科环状病毒属，它分布于全球大多数热带地区，并且分布范围不断扩大，散发于亚热带、温带地区，成为了世界性的传染病[6-7]，目前全球已经发现的BTV共有27个血清型[8-10]。中国于1979年首次分离到BTV，目前已在我国的29 个省份检测到感染BTV的病畜[11]，并已鉴定出7个血清型(BTV1、2、3、4、12、15、16)[12]，其中BTV1和BTV16为优势血清型[13]。虽然蓝舌病还未在我国暴发过，但我国地域辽阔，气候环境多样，适合虫媒病毒媒介生存繁殖的地域也很多，目前已发现绝大多数地区都存在该病毒的感染，且目前暂未出现能有效预防蓝舌病的疫苗，由此可见，我国发生该病的风险很大，开展大规模蓝舌病血清学调查研究尤为迫切。本试验采用BTV竞争酶联免疫吸附法(C-ELISA)对2015-2017年我国重庆、新疆、西藏、湖北、河北、广西、贵州、内蒙古、吉林、辽宁、四川、云南共12个省区的19 237份血清进行检测，其结果将为我国蓝舌病的风险防控提供重要依据和参考[14]。

1 材料与方法

1.1 主要材料及仪器 血清样品(n=19 237)由各省市(地区)的动物防疫控制中心采集，常规分离，-20 ℃保存；BTV C-ELISA检测试剂盒，由云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室提供；BioTek ELX-800酶标仪；AquaMax 2000洗板机，购自Molecular Devices公司。

1.2 血清BTV C-ELISA检测 用本实验室建立的BTV C-ELISA试剂盒检测中国12个省62个地区的血清抗体水平，共计19 237份样品，取试剂盒提供的ELISA板，每孔分别加入10 μL的待检血清和阳性、弱阳性、阴性对照血清，每份样品设2孔平行，置37 ℃温育30 min后，用试剂盒提供的样品稀释液按照1∶100倍稀释兔抗BTV抗体，每孔加50 μL，37 ℃ 温箱里温育60 min后，用PBST洗液洗板2次，拍干，按1∶1 000倍稀释羊抗兔IgG-HRP酶标抗体，每孔加50 μL；37 ℃温箱里温育30 min后，用PBST洗液洗板5次，拍干，每孔加入50 μL底物反应液，37 ℃避光温育10 min后，每孔加入终止液50 μL终止反应，15 min内在酶标仪450 nm波长下读取OD值。

1.3 结果判定 当2个阳性对照孔OD450≤0.2，2个孔间OD450 nm差距小于0.05，且2个阴性对照孔1.0≤OD450<1.6，2个孔间OD450差距小于0.2时，表明试验成立，根据公式计算抑制率(PI)=(阴性对照OD450平均值-样品血清OD450)/阴性对照OD450平均值×100%，当抑制率≥50%时判为抗体阳性，否则为阴性。

2 结果

2.1 BTV血清学调查 12个省区的BTV抗体平均阳性率见表1，结果表明，被调查地区的BTV血清阳性率呈现明显地域特征，具体表现为低纬度地区普遍高于高纬度地区，植被丰富地区高于同纬度的其他地区。试验结果显示，BTV阳性率最高的3个省为广西、重庆和云南，平均阳性率分别为38.14%、24.59%和23.34%，BTV阳性率最低的3个省为辽宁、吉林、河北，平均阳性率分别为4.33%、8.63%和9.87%，而纬度相近的内蒙古地区BTV平均阳性率(10.88%)远高于旁省，说明了茂盛的植被与草场也是影响虫媒病毒传播的重要因素，另外，高海拔的西藏地区，BTV阳性率高达22.39%，可能的原因是被调查地区大多位于西藏东南地区的雅鲁藏布江谷地，当地气候温暖湿润，为BTV的媒介传播创造了有利条件，致使当地牛、羊的BTV血清阳性率升高。

表1 我国部分省份牛羊血清样品及检测结果

2.2 不同动物BTV的感染率 本试验对6个省份同一地区在同一时间采集的牛、羊血清进行检测，来比较不同动物BTV的血清阳性率，结果表明(见表2)，除云南省外(牛42.3%、羊28.7%)，所有地区的羊血清阳性率(16.7%～62.6%)均高于牛(0～28.4%)；通过比较内蒙古、新疆的绵羊和山羊的血清阳性率，可以得出2个地区绵羊血清的阳性率(36.0%、37.1%)均高于山羊(16.7%、24.1%)，综上，BTV的易感程度绵羊>山羊>牛。

表2 不同动物BTV抗体阳性率比较

2.3 不同季节BTV的感染率 本试验对云南省德宏、曲靖和普洱这3个地区不同季节采集的牛、羊血清进行检测，结果显示，牛、羊血清的BTV阳性率具有明显的季节性(表3)，其中以第1季度(1～3月)平均阳性率最低，牛血清为0～13.3%，羊血清为6.7%～13.3%；第3季度(7～9月)平均阳性率最高，牛血清为38.3%～41.7%，羊血清为23.3%～46.7%；由于夏季湿热的气候利于虫媒的繁殖和活动，导致血清阳性率在第2季度(4～6月)逐渐升高，其中牛血清第2季度(4～6月)BTV平均阳性率27.8%～28.9%，羊血清为15.6%～31.1%，到第3季度牛羊血清阳性率均达到最高值，到第4季度(10～12月)由于冬季气温低，虫媒活动不频繁，阳性率也随之降低，其中牛血清平均阳性率为10.0%～16.7%，羊血清11.7%～20.0%。综上，BTV牛羊血清阳性率第3季度>第2季度>第4季度>第1季度。

表3 不同季节BTV抗体阳性率比较

3 讨论

蓝舌病作为虫媒病毒[15]，传播媒介和储存宿主较多，一种媒介又可以传播多种病毒，增大虫媒病毒的防控难度，且目前没有有效的预防措施和治疗方法，主要通过扑杀带毒动物及防治虫媒来阻止病毒的传播；我国幅员辽阔，自然环境复杂，虫媒病毒传播媒介种类多，分布广，危害严重，因此，系统地调查BTV在我国的血清学流行情况任务迫切。

本试验选取了在气候海拔等方面都极具代表性的12个省62个地区作为调查对象，从 2015-2017年的试验结果显示，被调查的12个省份均存在BTV的流行。

虫媒病毒的流行性主要取决于虫媒的活动情况[16]，极易受外界环境中温度、湿度、海拔等因素影响，因此具有明显的地域性和季节性。有研究表明，蓝舌病主要存在于南纬35°到北纬40°的地区，本试验调查的地区几乎都在这个纬度区间内，解释了被调查的地区均存在BTV感染的现象。

本试验调查的12个省(区、市)中，BTV抗体阳性率最低的3个地区是辽宁、吉林和河北，BTV年平均阳性率分别为4.33%、8.63%和9.87%，可能的原因是高纬度高寒地区不利于虫媒的生存和繁殖，导致了BTV阳性率远低于其他地区，而相同纬度的内蒙古自治区BTV年平均阳性率略高(10.88%)的可能原因是草场茂盛，而草地适宜的气候和湿度为虫媒的生长和繁殖创造了条件，导致其阳性率升高；而长江以南的大部分地区因为适宜的海拔和气候条件使得BTV在当地盛行，其中阳性率最高的3个地区为广西、重庆、云南，BTV年平均阳性率分别为38.14%、24.59%、23.34%，远高于全国年平均水平；值得注意的是，西藏作为高海拔高寒地区，BTV年平均阳性率也高达22.39%，可能的原因是染病动物通过贸易被带到西藏地区，也可能是库蠓适应能力增强，变异出适应高海拔、高寒环境的品种[17]，并且本试验调查的拉萨及日喀则地区位于雅鲁藏布江谷地，气候温暖湿润，地势较低，属于热带山地气候，适合虫媒生长，为BTV传播创造了条件。

本试验通过对云南省德宏、曲靖、普洱三地不同季度采集的牛羊血清的检测发现，山羊对BTV的感染率低于牛，与其他调查地区的结果相悖，可能的原因有几个，首先云岭牛的皮肤表面积大，被毛短，叮咬面积远大于山羊，增大了BTV感染的可能；其次云南省肉牛养殖量大，虫媒通过长期叮咬牛已经变异出适应牛的品种，所以偏好于叮咬牛；另外云南的云岭山羊品种不同于成都的麻羊、贵州白山羊等，也可能导致了BTV感染率上的差异。本试验还发现BTV的流行具有明显季节性，牛羊血清阳性率在第2季度(4～6月)逐渐升高，到第3季度(7～9月)达到顶峰，又在第4季度(10～12月)逐渐降低，以第1季度(1～3月)牛羊血清阳性率最低。由于BTV是虫媒病毒，它的传播依赖媒介，所以感染率与虫媒活动密切相关，夏季天气炎热湿度又大，虫媒活动频繁，所以BTV阳性率在夏季逐渐升高，到秋季到达顶峰，随着入冬气温下降阳性率又逐渐降低，到第1季度BTV血清阳性率呈现最低，呈明显季节性。

本试验通过对2015-2017年全国12个省62个地区共计19 237份血清样品的调查研究，明确了蓝舌病在被调查的地区均有流行，同时发现在中国西藏等高海拔寒冷地区，有蓝舌病病毒和传播媒介存在，值得进一步深入研究。本试验调查范围广，样本数量多，为了解中国各地区BTV的流行情况提供了血清学佐证，也为准确评估蓝舌病在我国的危害以及制定有效防治措施提供了可靠依据。