攀枝花市首例食源感染菌血症病例中分离的乌撒拉茂沙门菌的生物学特征

陈 嫣，顾桂敏，庞载元，杨晓蓉，雷高鹏，封正娟，沈来红，白永华，许学斌

2019年5月15日，我们从攀枝花市中心医院1例临床疑似脓毒血症感染男性患者血液标本中分离的1株肠道沙门菌(亚种Ⅰ)，通过形态学、系统生化和血清学鉴定为乌撒拉茂沙门菌(SalmonellaUzaramo，1,6,14,25:z4,z24:-)，经国内同行验证和沙门菌血清型数据库比对属国内首次分离并报道的食源性沙门菌的致病菌型和临床血流感染病例，病例株耐药和分子克隆特征有别于环境水源菌株。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1病例调查 患者为50岁男性，四川省攀枝花市人。2019年5月14日上午因房颤、高血压、高血压心脏病至四川省攀枝花市中心医院心血管内科住院治疗。入院体检时体征正常，主诉午餐在院外米线店点食过1份米线(主料为加工熟制米线，其他荤素配料和辅食均不详)，餐后回家取住院物品后即返回病房。15日凌晨(2点)，患者经过潜伏期后的急性发病期：高热、寒颤、头痛伴腹泻、体温达39.9 ℃、呼吸困难，实验室检查：白细胞12.97×109/L(比值87.80%)；粪便性状黄色水样、红细胞0～2个/高倍视野(HP)，白细胞30～50个/HP，隐血试验阳性；临床紧急以黄连素口服和庆大霉素8万单位肌注处置；1 h后患者体温有所下降(39.0 ℃)、2 h后患者体温突然升高(40 ℃)伴黄色水样便伴里急后重、有恶心和呕吐，临床改施头孢派酮/舒巴坦和泮托拉唑抑酸处置；第2 d(16日)患者体温正常、无腹痛和里急后重、仍黄色水样腹泻伴恶心、呕吐，医嘱继续抗感染和蒙脱石散止泻；第3 d(17日)主治医生查房：病情好转，白细胞7.53×109/L(比值84.10%)；第5 d(19日)患者体温正常、无腹泻，血培养报告检出沙门菌、粪便培养未见沙门菌和志贺菌，临床据此诊断为感染性腹泻并发菌血症，继续以头孢噻肟钠联合帕珠沙星、盐酸小檗碱强化治疗。第8 d(22日)患者体征正常，血常规正常，停抗生素；第9 d(23日)二次血培养阴性。回顾性流行病调查：患者1个月内无旅游史，家中无饲养宠物，直系亲属亦无不适。根据诊断病原菌的潜伏期判断患者暴露源于不洁(或交叉污染)就餐环境，偶然摄入病原菌所致孤立、散发案例，调查中也未见后续和加工熟制米线相关病例，见图1。

图1 乌撒拉茂沙门菌血流感染病例的病程时间轴Fig.1 Timeline of course in cases of blood stream infection with Salmonella Uzaramo

1.2培养基、试剂和仪器 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂平板(XLD，北京路桥技术有限公司，北京)；肠道菌发酵双糖管和沙门菌显色琼脂平板(无锡市赛微生物技术有限公司，无锡)；全自动微生物鉴定系统VITEK2(生物梅里埃，法国)；沙门菌H抗原诱导培养基swarmagar和60种、130种沙门菌分型诊断血清(SSI，丹麦)；沙门菌分型智能导航系统(上海景学微生物应用技术有限责任公司，上海)；抗生素药敏定量测试板条(CMV3AGNF，赛默飞，美国)；限制性内切酶XbaⅠ(TAKARA，日本)；低熔点琼脂糖(伯乐，美国)，以上试剂和血清等均避光置10 ℃以下保存，有效期内使用。PCR电泳仪和脉冲凝胶电泳仪(CHEF mapper system)与凝胶成像系统(GEL Doc2000，伯乐公司，美国)；菌液比浊仪(生物梅里埃，法国)；抗生素自动分液和读数系统(赛默飞，美国)。

1.3脉冲场凝胶电泳(PFGE) 按照PulseNet China技术方案规定的非伤寒沙门菌PFGE-XbaⅠ标准方法，完成2株乌撒拉茂沙门菌(四川攀枝花1株临床血源；广西南宁1株自然水体源)的酶切分型、凝胶电泳使用BioNumerics(Version 6.0)软件进行聚类分析。

1.4药敏试验 检测方法参考美国国家肠道病原菌耐药监测系统(NARMS，2014年度版)更新的9类14种抗生素和操作流程(SOP)及最低抑菌浓度(MIC)判读标准，质控菌株为大肠埃希菌(ATCC25922)：头孢西丁(FOX)、阿奇霉素(AZI)、氯霉素(CHL)、四环素(TET)、头孢曲松(AXO)、阿莫斯林-克拉维酸(AUG2)、环丙沙星(CIP)、庆大霉素(GEN)、萘啶酸(NAL)、头孢噻呋(XNL)、磺胺异噁唑(FIS)、复方新诺明(SXT)、氨苄西林(AMP)、链霉素(STR)。多重耐药菌(MDR)：至少同时耐3类以上抗生素的菌株。分别测试2株不同来源的乌撒拉茂沙门菌。

1.5基因表型 根据文献的耐药和毒力基因进行引物合成(生工，上海)、PCR扩增和凝胶电泳检测2株乌撒拉茂沙门菌的耐药基因：β-内酰胺酶类(blaTEM、blaOXA、blaSHV);磺胺类(sull、sul2、sul3、dfr);四环素类(tetA、tetB)；链霉素类(strA、strB、aadA);1类整合子(intll、qacEDI);毒力基因(inv4、hilA、ssaQ、ssrB、mgtC、spi4D、sopB、sciN、safB、viaB、stn、pltA)[1]。分别测试2株不同来源的乌撒拉茂沙门菌。

2 结 果

2.1菌株表型特征 菌株接种XLD经36 ℃培养24 h后，菌落呈圆形、湿润、边缘光滑无色半透明、中心黑色；沙门菌显色平板呈紫红色、圆形、湿润的菌落特征。分别挑选XLD和沙门菌显色平板生长单个典型菌落穿刺接种肠道菌发酵双糖管，36 ℃培养24 h：管1发酵甘露醇，葡萄糖产酸产气，尿酶阴性；管2蔗糖、吲哚阴性，动力、硫化氢阳性，初步生化筛选符合沙门菌属特征。全自动微生物鉴定系统鉴定为沙门菌属，见表1。

2.2血清学鉴定 分别使用哥伦比亚斜面和抗原诱导培养基配合丹麦沙门菌分型血清诊断菌株O、H抗原，其抗原式为1,6,14,25:z4,z24:-。依据最新公布的国际沙门菌抗原表[2]判断为：乌撒拉茂沙门菌。经四川省疾病预防控制中心验证复核，结果一致、后经上海市疾病预防控制中心许学斌教授比对复核并经沙门菌分型智能导航系统验证，均鉴定为乌撒拉茂沙门菌。

2.3药敏试验 本次血流分离的乌撒拉茂沙门菌除对氯霉素中度敏感、对链霉素耐药外，对其他抗生素菌敏感；环境水体的乌撒拉茂沙门菌属MDR：对头孢噻呋和环丙沙星中度敏感；对四环素、头孢西丁、氯霉素、复方新诺明、磺胺异噁唑、萘啶酸、链霉素均耐药，见图2。

2.4基因表型 血流的乌撒拉茂沙门菌对5类耐药基因除链霉素(strA、srtB、aad)外均为阴性，水源株对四环素(tetA、tetB)和链霉素(strA、strB、aad)耐药基因阳性，耐药基因结果和药敏试验结果一致；血流乌撒拉茂沙门菌12个毒力基因均为阳性，水源株仅有6个为阳性(invA、hilA、ssaQ、ssrB、mgtC、sopB)，见图2。

2.5PFGE 本次来自血流的人源型乌撒拉茂沙门菌和数据库收录来自广西南宁市北沟湖分离的1株乌撒拉茂沙门菌通过酶切和电泳图谱聚类分析比对，两者的带型存在较大差异，遗传同源性仅有58%的相似度，见图2。

图2 乌撒拉茂沙门菌PFGE聚类分析(限制性内切酶：XbaI)Fig.2 Cluster analysis based on PFGE of Salmonella Uzaramo (Restrictive Endochase:XbaI)

3 讨 论

沙门菌血清型最新公布共2 659[3]。我国2006年至2014通过国际交流合作和技术引进重新确认人源和非人源沙门菌血清型有133个[2,4]。随着国内食物供应链多样化和食品安全机构重视沙门菌风险监测，将有更多非伤寒沙门菌型被报道[5]。本次自临床血流感染病例分离和鉴定的乌撒拉茂沙门菌经专业实验室复核和国内医学情报机构查新证实属国内首次临床报告病例。基于全基因组测序的菌型确认和数据分析另文报告。

本次乌撒拉茂病例源于当地小型餐饮机构的食源性暴露，病菌经口摄入经消化道或肠内粘膜入血致全身感染(严重可致脓毒血症)，急性发作期导致机体应激反应强烈，所幸患者正值原发性高血压住院期间，医护抢救及时否则存在休克死亡风险。诊疗初期庆大霉素肌注的措施值得商榷，未考虑肌注入血的庆大霉素直接作用于菌体成为内毒素致热源(菌体抗原)刺激体温迅速升高的应激后果。细菌性腹泻不用抗生素治疗对预后有保护性作用的最近实践是2012年德国EHECO104病例[6]。美国临床实验室标准机构(CLSI)建议对感染沙门菌病例应限制使用氨基糖苷类药物。国内临床实验室普遍对沙门菌感染相关病原学与诊疗能力不足，是导致经验用药的直接原因[7]。血培养证实本次感染的病原为乌撒拉茂沙门菌，我们通过国内沙门菌血清型数据库比对证实属国内首次发现的人感染沙门菌型[3,5]，1株同型菌来自广西南宁市的湖水。两者耐药性不同，临床菌株对抗生素几乎全敏感，而水源株为MDR，提示菌株在环境中有机会获得更强耐药性；基因型和分子型提示两者的耐药、毒力基因和遗传相似性较低，临床株毒力强而耐药性低，环境株表型特征则相反。该病例为充实我国现有非伤寒沙门菌型多样性和临床诊疗及溯源研究有重要意义。该菌型的生物学特征和临床病例类伤寒、类脓毒血症的侵袭性症状值得同行关注，因为人群对非主流沙门菌型可能缺少保护性抗体而变得易感，个别罹患基础性疾病的患者可能增加致死率。

乌撒拉茂沙门菌首次报道于1951年[2]。感染者病例多和养殖宠物蛇有关[8]。儿童是罕见血清型易感者缘于家养宠物(龟、蜥蜴、蛇)的接触[9]。美国是乌撒拉茂病例最多的国家：2006-2016年有13例[10]。本次患者无宠物接触史和外出旅游史，暴露源于不洁饮食，未能对病例溯源取证调查找到乌撒拉茂的源头使本次的结论存在局限性：无法明确米线污染源于加工过程还是环境导致(交叉污染)。攀枝花地区处于四川省最南部，毗邻云贵，气候湿热、水系发达，乌撒拉茂本地或外来输入均有可能，期待通过后续省级和国家致病菌监测网络分享信息、追溯源头。

近10年我国的食物供应逐渐从传统自足自给型向全球化采购转变，加之人口老龄化因素，必然加重更多的侵袭性、非伤寒沙门菌型病例的疾病负担[11]。我国侵袭性沙门菌血清型病例提示甲鱼和宠物龟等爬行动物中存在高致病性克隆、对抗生素多敏感[12-13]。乌撒拉茂沙门菌是我们首次证实国内临床血流感染的罕见沙门菌型病例，建议从城市健康角度出发，加强医防结合和传染病生态行为宣教，结合暴发病例溯源，做好生态学监测，防控重点人群降低非伤寒沙门菌疾病负担。

利益冲突：无