Slug、IMP3和miR-221在食管胃交界腺癌的表达及其与E-cadherin的关系

姜琳娜，魏 娉

邯郸市第一医院病理科，河北 邯郸 056002

食管胃交界腺癌(adenocarcinoma of the esophagogastric junction，AEG)是横跨食管胃交界处的腺癌，分析AEG的转移机制和临床标志物对于AEG的临床治疗策略及手术方案的选择具有重要意义[1]。AEG是一种上皮细胞，其转移与细胞的上皮-间充质转化密切相关，E-钙黏蛋白(E-cadherin)是维持细胞紧密连接的关键蛋白，是细胞呈上皮性的蛋白，E-cadherin的缺失会引起细胞活动侵袭及转移扩散，E-cadherin的缺失与胃癌和食管癌的转移密切相关[2-3]。本次研究通过检索国内外文献，检索与胃癌或食管癌或肿瘤转移有关的基因，选择有免疫组化染色或转录检测结果但是关于其在AEG中的意义尚不清楚的三种基因进行本次研究。Slug又被称为Snail2，是Snail家族成员，也是控制上皮-间充质转化基因表达的转录因子，不但参与癌症的起始，也在肿瘤的转移中发挥重要作用，研究已经显示了Slug 与胃癌的不良预后有关[4]，但关于Slug在AEG患者中的临床意义尚不明确。胰岛素样生长因子Ⅱ mRNA结合蛋白3(insulin-like growth factor Ⅱ mRNA-binding protein 3，IMP3)是一种癌胚蛋白，仅在人类癌组织和人类早期胚胎发生中被检测到，正常组织中几乎不表达[5]。国内研究显示，IMP3在神经胶质瘤和乳腺癌中有表达，但是关于IMP在胃癌以及AEG中的表达特点和意义尚不清楚[6-7]。微小RNA(microRNA，miR)-221是一种具有促癌作用的miRNA，可通过调节靶基因的表达促进胃癌细胞的迁移和侵袭[8]，但是目前尚无关于miR-221在AEG中的研究。因此本文主要分析Slug、IMP3和miR-221在AEG中的临床意义及其与E-cadherin的相关性，为更好的临床诊断AEG并探究AEG的发病机制提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取邯郸市第一医院2017年12月至2019年6月确诊的AEG患者100例作为研究对象，男58例，女42例，年龄36～78岁。收集同期体检者正常胃组织50例作为健康组，男28例，女22例，年龄33～75岁，本研究获得邯郸市第一医院伦理委员批准。纳入标准：(1)年龄≥20岁；(2)术后经病理学检测确诊为AEG[9]；(3)首次确诊；(4)知情同意。排除标准：(1)合并其他类型原发性恶性肿瘤；(2)入组前3个月内接受化疗、放疗等治疗；(3)哺乳期或妊娠期妇女。

1.2 研究指标和方法经过手术或全身PET-CT检测AEG转移情况。通过qPCR检测组织中miR-221的表达水平。通过免疫组化染色检测组织中E-cadherin、Slug、IMP3的表达。

1.3 免疫组化染色检测Slug、IMP3的表达将组织样本梯度酒精脱水、透明、浸蜡处理后包埋至蜡块，冷冻20 min后切成4 μm切片并在65 ℃下烘烤30 min。然后将切片样本常规脱蜡、水化和抗原修复，加入3%过氧化氢溶液(双氧水∶纯水=1∶9)阻断内源性过氧化物酶，使用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30 min。加入1∶100稀释的anti-E-cadherin(ab1416，Abcam公司，美国)、anti-Slug(ab180714，Abcam公司，美国)或anti-IMP3(ab179807，Abcam公司，美国)并在37 ℃孵育60 min，PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min。洗涤后加入100 μl增强酶标山羊抗兔IgG聚合物覆盖组织，室温孵育60 min。滴加DAB显色5～6 min复染后使用苏木紫染色20 min，然后脱水透明，封片后使用显微镜观察染色结果。

免疫组化染色的结果由两名主治医师独立进行，且均不知每个切片的来源，通过半定量分析将蛋白质表达分析为阴性和阳性。阳性染色为黄棕色颗粒。染色强度分级：0级：无色，0分； 1级：浅黄色，1分； 2级：黄色，2分； 3级：棕黄色，3分。染色范围评分，每个切片选择5个典型的高倍视野，连续计数100个细胞，<5%的阳性细胞数为0分；5%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；76%～100%是4分。将染色强度和染色范围分数相乘以获得最终的免疫组织化学分数：0～2分为阴性表达，3～4分为弱阳性，5～6分为中度阳性，7～12分为强阳性。最终染色结果判定：0～4分为阴性，5～12分为阳性。若得分有差异则通过两位评估者之间的讨论解决。

1.4 qPCR检测组织中miR-221的表达使用Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)获得组织中总RNA并检测RNA的浓度和纯度。使用逆转录cDNA试剂盒(Roche公司，瑞士)逆转录1 μg RNA用于合成cDNA(42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix qPCR试剂盒(Roche公司，瑞士)和PCR检测系统(ABI 7500，Life technology公司，美国)进行qPCR实验(95 ℃ 10 min，40个循环，94 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，4 ℃保存)。比较循环阈值(ΔΔCt)用于分析RNA的表达。U6用于标准化。miR-221上游引物：5′-GGGAAGCTACATTGTCTGC-3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

2 结果

2.1 E-cadherin、Slug、IMP3和miR-221在AEG中的表达免疫组化研究结果显示，E-cadherin、Slug、IMP3均表达于细胞质(见图1～3)。且根据染色的实际结果关于染色误差的考虑，将中阳性和强阳性列为“阳性”进行后续研究。AEG组织中Slug、IMP3阳性率及miR-221相对表达量均显著高于健康组织(P<0.05)(见表1)。

2.2 Slug、IMP3、miR-221与AEG患者一般资料、病理特点和E-cadherin间的关系性别、年龄及肿瘤大小对AEG组织中Slug、IMP3阳性率及miR-221水平的影响不大(P>0.05)，Ⅲ/Ⅳ分期、出现局部浸润、淋巴转移、远端转移患者的AEG组织中Slug、IMP3阳性率及miR-221水平显著升高(P<0.05)，且E-cadherin阳性组织中Slug、IMP3阳性率显著低于E-cadherin阴性组织(P<0.05)，miR-221水平显著低于E-cadherin阴性组织(P<0.05)(见表2)。

图1 免疫组化染色检测E-cadherin、Slug、IMP3的表达(放大200)Fig 1 Immunohistochemical staining for detection of E-cadherin, Slug and IMP3 expressions

表1 两组Slug、IMP3阳性率及miR-221相对表达量比较Tab 1 Comparison of Slug, IMP3 positive rate and miR-221 relative expression in the two groups

表2 Slug、IMP3、miR-221与AEG患者一般资料和病理特点间的关系Tab 2 Relationship between general data and pathological features of Slug, IMP3, miR-221 and AEG patients

3 讨论

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，虽然近年来新的检测技术和治疗方法被不断应用临床，胃癌的5年生存率仍不能令人满意。胃癌的转移和复发是影响治疗效果和预后的重要因素。胃癌可发生在不同部位，AEG是原发于食管和胃交界处的恶性肿瘤，具有独特的临床病理特征和生物学行为，AEG的侵袭性和复发性可能更高。E-cadherin蛋白是维持细胞间紧密连接的蛋白，也是重要的上皮表型标志蛋白，E-cadherin的减少会使细胞间的紧密连接丢失并促进上皮细胞向间充质细胞转化，是肿瘤细胞获得转移能力的重要机制，且E-cadherin蛋白在胃癌转移和预后中的作用已经被证实[10]。因此，分析AEG转移和复发的机制，评估AEG的复发风险，并分析基因表达水平与E-cadherin的关系在临床上具有重要意义。

本研究通过检索国内外文献，找出胃癌或食管癌或肿瘤转移有关的基因，选择有免疫组化染色或者转录检测结果但是关于其在AEG中的临床意义尚不清楚的3种基因进行本次研究，根据检索结果和我们课题组的研究方向，我们选择了Slug、IMP3和miR-221 3种基因。Slug主要存在于细胞质，是一种转录调节基因，参与细胞的上皮-间充质转化[11]。本次研究结果显示，AEG组织中Slug水平显著升高，Ⅲ/Ⅳ分期、出现局部浸润、淋巴转移、远端转移的患者中Slug阳性率水平显著升高，且E-cadherin阳性组织中Slug阳性率显著低于E-cadherin阴性。Chen等[12]的临床研究结果显示，Slug在胃癌中过表达，并且Slug被激活后会促进胃癌细胞迁移和侵袭，靶向Slug可能是一种治疗转移性胃癌的新思路。Lee等[13]的研究也显示了朝鲜族胃癌患者组织中Slug与更高的淋巴结转移风险和复发率具有相关性，但是关于Slug在中国AEG患者中的表达意义尚不清楚。此外，一项体外研究发现了激活Slug会促进E-cadherin的表达，并促进胃癌细胞的迁移和侵袭[14]。结合过往研究和本次研究结果，提示Slug可能具有促进AEG细胞的上皮-间充质转化的作用，从而促进AEG转移，可作为预测AEG转移和预后的标志因子。

IMP3位于染色体7p11，是RNA结合蛋白家族的成员，可调节mRNA的翻译和稳定性，在胚胎发育的早期阶段、细胞生长、细胞迁移、运输和稳定中起着重要作用，IMP3与肿瘤的转移或不良预后有关，包括结直肠癌、胶质瘤、肾细胞癌等[15-17]。Lee等[18]研究显示，在胃癌中，IMP3的表达水平升高，可能发挥促癌作用。Damasceno等[19]研究显示，外周血中IMP3 mRNA的水平升高，胃癌组织中的IMP3蛋白表达水平也升高并且与胃癌的恶性表型有关。国内也有研究显示，IMP3阳性表达与Ki-67表达、临床分期、是否有淋巴转移及是否侵犯浆膜层有关[20]。此外，在葡萄胎中，IMP3与E-cadherin的水平呈正相关，且与胚胎浸润性有关[21]。本研究结果显示，AEG组织中IMP3上调，Ⅲ/Ⅳ分期、局部浸润、淋巴转移、远端转移患者癌组织中IMP3阳性率显著升高，且E-cadherin阳性组织中IMP3阳性率显著低于E-cadherin阴性。这提示在AEG中，IMP3也发挥促进肿瘤增殖和转移的作用，可用于预测AEG的病情和预后。

miR-221作为一种miRNA，可在转录后通过靶向结合mRNA的3’UTR区域诱导mRNA降解，从而调节基因的表达水平。研究已经证实了miR-221是乳腺癌细胞获得对顺铂抗性的重要调节基因[22]。并且在结直肠癌、卵巢癌等[23-24]中发挥促癌作用，并且可作为喉癌的生物标志因子[25]。本次研究结果显示，AEG组织中miR-221上调，Ⅲ/Ⅳ分期、有局部浸润、淋巴转移、远端转移患者的AEG组织中miR-221相对表达水平显著升高，并且E-cadherin阳性组织中miR-221显著低于E-cadherin阴性。有研究显示，在伊朗胃癌患者中，miR-221过表达与胃癌恶性表型有关[26]。Liu等[27]通过体外细胞实验发现了miR-221可通过靶向抑制RECK的表达促进胃癌细胞的迁移和侵袭。Pan等[28]研究认为，Slug可通过促进miR-221的水平抑制E-cadherin的表达，并促进乳腺癌的进展。这提示miR-221可作为预测AEG预后的标志因子，但是关于外周血中的miR-221水平我们尚未研究，但这值得进一步探讨。

综上所述，Slug、IMP3和miR-221在AEG中均过表达，与AEG转移有关，且与E-cadherin水平呈负相关，提示Slug、IMP3和miR-221可作为AEG的生物标志物。但癌症分子通路种类繁多，其中涉及的蛋白更是数以万计，目前尚无法对所有AEG相关的蛋白研究透彻。但本研究通过已有文献选择了与AEG有关且较新、研究较少的3种基因进行了研究，对AEG的治疗具有一定的价值。