大丽轮枝菌与陆地棉互作过程中棉花次生代谢产物分析

李社增，牛露欣，李博超，陈秀叶，刘畅，鹿秀云，郭庆港，马平*，马峙英

（1.河北农业大学/ 教育部华北作物种质资源重点实验室，河北 保定071000；2.河北省农林科学院植物保护研究所/ 河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心/ 农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室，河北保定071000；3.南加州大学生物医学工程系，美国 洛杉矶90089；4.南京农业大学植物保护学院，南京210095）

棉花（Gossypium spp.）作为世界上最重要的经济作物之一和纺织工业天然纤维的主要来源，在世界30 多个国家均有种植， 已成为许多发展中国家的经济支柱[1]。 陆地棉（G.hirsutum）因其产量高、纤维品质好，是世界上栽培最广泛的棉种，占世界棉花种植面积的92%～95%[2]。 在陆地棉上，由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的棉花黄萎病是1 种严重的土传真菌病害，每年给棉花生产造成巨大损失[3-6]。 许多学者认为，种植抗黄萎病棉花品种是防治黄萎病最经济有效的措施[7-8]；但由于缺乏抗源材料，抗病棉花育种工作受到极大限制[9]。 自1974 年在海岛棉（G.barbadense） 中发现对黄萎病高抗性基因后[10]，近50 年来，通过远缘杂交、传统棉花育种等方法，在改善陆地棉对黄萎病的抗性方面取得了实质性进展[11-13]。 同时，随着分子生物学的发展，棉花分子育种研究越来越受到科学家的重视，通过导入外源抗病基因或改造调控基因提高了陆地棉对黄萎病的抗性[14-17]。 尽管在通过传统育种和分子育种提高棉花抗病性方面取得了重要进展，但这些相关技术和抗性资源材料仍不能满足棉花生产的需求。

为了加速棉花抗病分子育种， 在转录组、蛋白质组和代谢组水平进一步解析棉花抗黄萎病机制是非常必要的。 近几十年来，棉花防御大丽轮枝菌的机制研究取得了一些进展。 例如，棉花的防御机制主要依赖于预先形成的防御结构（厚角质层）和酚类化合物的合成来阻止病原菌的侵入，并通过加强细胞壁结构，释放植保素（黄酮类、酚类和倍半萜类）[18-19]、脂质转移蛋白[20]和苯丙酸等物质[21]，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）积累[22-23]和系统获得抗性（Systemic acquired resistance，SAR）[24]等特殊抗性反应阻止或延缓病原菌在棉花植株内的扩展。 然而，棉花对大丽轮枝菌的这些防御机制研究成果仍然不足以用于提高棉花抗病育种的效率[25]。因此，在不同组学水平上研究棉花对大丽轮枝菌的防御机制，挖掘多种与棉花抗病性相关的物质，对改进棉花抗病育种策略具有重要的理论和应用价值。

代谢组学是对生物体内所有代谢产物组成的分析。 对生物体完整代谢组学的研究可进一步解释转录组和蛋白质组的最终结果，且代谢组的变化将为相应基因表达的潜在变化提供有力证据[26]。因此，研究大丽轮枝菌与棉花互作过程中代谢组的动态变化，有助于分析代谢途径，解析代谢产物的生物学作用。 在代谢组分析中，明确代谢产物的种类尤为重要。 然而，由于代谢物的化学种类繁多且含量变化范围大，缺乏能够同时分离和检测所有代谢物的单一分析方法，完整代谢组的分析需要不同的互补分析技术， 所以建立高效的分析方法是代谢组分析中1 项具有技术挑战性的工作。 自从一些科学家通过气相色谱-质谱（Gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）[27-28]或液相色谱- 质谱（Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[29-30]完成对拟南芥、番茄等植物提取物分析后，色谱与质谱相结合的综合分析技术被证明对代谢组分析而言是1种高效的和最灵敏的方法。

本研究利用超高效液相色谱电喷雾质谱（Ultra-performance liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry，UPLC-ESIMS）方法，着重针对大丽轮枝菌- 陆地棉互作过程中次生代谢产物开展研究，在代谢组学水平上揭示病原菌与棉花互作过程中棉花次生代谢产物变化情况， 旨在丰富棉花代谢组学研究数据，为通过病程相关次生代谢产物揭示棉花抗病机制提供科学依据，为进一步基于分子调控技术的抗病棉花品种高效选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 棉花育苗与样品材料准备

1.1.1 棉花育苗。 将土和草炭按质量比2∶1 混匀作为育苗基质，121 ℃间歇灭菌2 次，每次1 h，间隔时间1 d。供试棉花品种为中棉所24（中国农业科学院棉花研究所李付广博士提供）， 为早熟棉，纤维品质优良，在田间人工棉花黄萎病病圃（土壤中优势病原菌为大丽轮枝菌WX-1 菌株）抗病性鉴定试验中，2 年均表现为感病。棉花种子用10%（质量分数）漂白粉消毒液与95%（体积分数）酒精的混合液（体积比1∶1）消毒5 min，用无菌水冲洗3 次后，播种于盛有育苗基质的书式育苗盒（长37 cm，宽22 cm，高15 cm）中，每个育苗盒共有32 个育苗孔，每孔播种2 粒种子。 将育苗盒置于25～30 ℃的温室中进行育苗， 根据棉花需求适当浇水。 棉苗出齐后，每个育苗孔中仅留健康棉苗1 棵。

1.1.2 病原菌接种液制备。 选用大丽轮枝菌WX-1 菌株（强致病力，分离自河北省威县棉花病株，由作者所在实验室保存）作为本研究的病原菌。 先将该菌在马铃薯葡萄糖琼脂 （Potato dextrose agar，PDA） 平板培养基上25 ℃下培养7～10 d。 在菌落边缘区域，用直径3 mm 无菌打孔器将其菌落制成菌片，将4～5 片菌片加到盛有100mL马铃薯葡萄糖培养液 （Potato dextrose broth，PDB）的三角瓶（300 mL）中，在25 ℃、160 r·min－1条件下振荡培养7 d。 然后用4 层无菌纱布过滤，制得病原菌分生孢子悬浮液，应用血球计数板检测其中病原菌分生孢子含量，并用无菌水将其制成分生孢子含量为107mL－1的悬浮液，作为病原菌接种液。

1.1.3 病原菌接种。 当棉苗生长到2 片真叶时，采用伤根接种法进行病原菌接种。 具体方法如下：将棉苗自育苗盒取出，用无菌剪刀在距根尖1.5 cm 处剪断棉根，再放回育苗盒。 将盛有伤根棉苗的育苗盒浸泡在盛有2 L 病原菌接种液的塑料盒（长40 cm，宽24 cm，深25 cm）中30 min，然后将育苗盒仍放回原来育苗环境中继续培养。 同时伤根棉苗在无菌水中浸泡30 min 作为健康对照处理。 每个处理重复3 次，每个重复1 个育苗盒，每盒32 棵棉苗。

1.1.4 棉花取样与处理。 Daayf 等[31]研究证明棉花在伤根接种病原菌7 d 时，茎部出现症状，表明病原菌与棉花发生了充分互作。 因此，本研究于病原菌接种后8 d 时，分别收集棉苗根、茎、叶的组织材料， 应用液氮冷冻干燥后用植物粉碎机（Scientz-48，北京同元聚物科技有限公司）研磨成粉末，并保存在－80 ℃冰箱中备用。

1.2 棉苗组织中代谢物提取

称取冷冻棉花组织粉末样品100 mg，在室温下解冻15 min，加入800 μL 溶剂[高效液相色谱（HPLC）级甲醇∶蒸馏水＝7∶3（体积比），甲醇购自Merck KGaA 公司]， 研磨1 min， 超声提取30 min，静置5 min，在12 000 r·min－1（4 ℃）下离心10 min， 取上清液100 μL 置于进样小瓶中，保存在4 ℃冰箱中备用。

1.3 液相色谱-质谱检测

应用超高效液相色谱电喷雾质谱仪（UPLCESI-MS）对棉苗组织提取物进行分析。 UPLC 仪为SHIMADZU LC-30 AD， 由日本Shimadzu 公司生产； 质谱仪为AB Triple TOF TM5600 system-MS/MS，由美国AB SCIEX 公司生产。

色谱条件： 色谱柱为Shim-pack GIST C18（直径2.1 mm，长100 mm，填料粒径2 μm），流动相A 相为0.1%（体积分数）甲酸水溶液，流动相B 相为0.1%（体积分数）甲酸乙腈溶液，流速0.35 mL·min－1，柱温40 ℃，自动进样器温度4 ℃，进样量4 μL。 每个样品3 次重复。 洗脱条件：0～1.0 min，5%（体积分数，下同）B；1.0～6.0 min，5%～20%B；6.0～9.0 min，20%～50%B；9.0～13.0 min，50%～95% B；13.0 ～15.0 min，95%B；15.0～15.2 min，95%～5% B；15.2～17.5 min，5%B。

正离子模式（Positive mode，ESI＋）质谱检测：喷雾气压（GAS1）344.7 kPa（50 psi），辅助加热气压（GAS2）413.7 kPa（60 psi），辅 助 加 热 气 温 度500 ℃，气帘气压（CUR）241.3 kPa（35 psi），离子化电压（IS）5 500 V，采集模式为信息依赖型采集（IDA）模式，飞行时间质谱（TOF-MS）质 荷比（m/z） 扫描范围50～1 500， 累积时间250 ms，TOF-MS/MS 二级m/z 扫描范围50～1 000，累积时间50 ms，去簇电压（DP）100 V，碰撞能量（CE）35 eV，扩展碰撞能量（CES）15 eV。

负离子模式（Negative mode，ESI－）质谱检测：辅助加热气压379.2 kPa（55 psi），气帘气压172.4 kPa（25 psi），离子化电压4 500 V，其他参数设置均与正离子模式质谱检测一致。

应用甲酸钠的相对分子质量作为锁定的相对分子质量，对质谱系统的稳定性及准确性进行校正，每6 个样品自动校正1 次。

1.4 数据预处理和分析

采用在线XCMS 软件对UPLC-ESI-MS 数据进行可视化和手工处理（https://xcmsonline.scripps.edu）[32]，进行特征离子峰提取、峰对齐、色谱峰识别及峰匹配，获得质荷比（m/z）、保留时间（Retention time，RT）和峰强度（Peak intensity）等数据， 进一步将RT、m/z 和峰强度等数据导出为.xlsx 文件，在MS Excel 2010 软件中手动搜索和编辑，包括杂质峰的消除和数据去噪。 将最终结果转化为数据矩阵（RT×m/z×峰强度），构建ESI＋和ESI－变量的2 个数据集，并用于进一步的数据分析。

采用SIMCA 14.1 软件（MKS Umetrics AB）和MS Excel 2010 软件对上述2 组数据集进行单因子和多元统计分析。 在SIMCA 14.1 软件中数据均采用Pareto scaling 标准处理。首先进行无监督的数据分析——主成分分析（Principal components analysis，PCA）， 观察各组数据的聚类并去除离群样本；然后采用正交偏最小二乘法判别分析（Orthogonal partial least square-discriminate analysis，OPLS-DA） 进行有监督的数据分析， 采用200 次置换检验防止OPLS-DA 模型的过度拟合， 进一步通过S-Plot 和模型参数R2X、R2Y、Q2评价OPLS-DA 模型的有效性， 计算变量的重要性值（VIP 值）。 应用MS Excel 软件t 检验，分析病原菌处理的特征离子峰强度与相应健康对照间的统计学差异。

1.5 病原菌- 棉花互作过程中重要次生代谢产物挖掘

根据OPLS-DA 模型的VIP 值（VIP 值＞1）、病原菌处理后棉花次生代谢产物的特征离子峰强度与相应健康对照间t 检验的p 值（p＜0.05）及峰强度变化，分析病原菌处理与健康对照间棉花次生代谢产物变化规律，筛选与棉花黄萎病病程相关的重要次生代谢产物。

1.6 重要次生代谢产物鉴定

首先， 根据现有的文献资料和在线数据库，获得已报道的有关棉花代谢产物信息并建立自有数据库。这些信息包括代谢产物名称、CAS 号、分子式、单同位素准确相对分子质量、信息来源。其次， 根据ESI＋和ESI－检测中加合物存在的一般规律[33]，利用Matlab 软件（Version 2018b，MathWorks,Inc.）编制计算程序（暂不公开），根据每个特征离子的m/z 计算出对应的所有可能的准确相对分子质量，进一步计算与自建棉花代谢产物数据库的各物质准确相对分子质量间的误差，根据锁定的相对分子质量检测误差设定误差阈值，以小于此阈值推定的匹配物质作为供试代谢产物的鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 目前明确的棉花代谢产物信息

基于文献和在线代谢物数据库，收集了有关棉花的代谢产物信息， 涵盖亚洲棉 （G. arboreum）、海岛棉（G.barbadense）、陆地棉（G.hirsutum）、草棉（G.herbaceum）和南岱华棉（G.sturtianum var.nandewarense）5 个种。 这些代谢产物属于极性、半极性和非极性化合物。 由于本研究用于植物代谢产物提取、分离和检测的程序偏向于半极性化合物，预期包括酚类、萜类、生物碱及其衍生物等次生代谢物将被检测到。 迄今为止，自棉花根、茎、叶、花和种子提取物中分离和检测到的代谢产物有111 种，包括萜类化合物61 种、酚类化合物6 种、黄酮类化合物26 种、生物碱6种、脂肪族天然产物6 种、碳水化合物5 种和简单芳香族天然产物1 种（附表1，印刷版省略，电子版参见本刊网站）。

2.2 棉苗组织的代谢谱

棉花根、茎、叶各组织的70%（体积分数）甲醇/ 水提取物能够通过UPLC-ESI-MS 进行分析，图1 为棉花根样本中代谢产物在正、负离子模式下UPLC-ESI-MS 总离子色谱图。 应用在线XCMS 软件分别对正离子模式和负离子模式下采集的原始质谱数据进行了处理，导出到.xlsx 文件中构建了2 个数据集（正离子代谢组数据和负离子代谢组数据），正离子模式检测获得4 572 个离子峰（ESI＋离子），负离子模式检测获得3 960个离子峰（ESI－离子），导出的数据中包含了各离子的RT、m/z 和峰强度。 ESI＋和ESI－离子的RT分别为0.14～17.39 min 和0.15～17.28 min，m/z分别为49.999 14～999.290 865 和61.990 806～1 497.974 607。 同时，根样本总离子图显示，棉花中常见代谢产物棉酚在2 个模式中保留时间和峰强度均有所不同：在正离子模式下，棉酚的保留时间为14.32～14.37 min （图1A）， 峰面积为4.5×105；负离子模式下，其保留时间为14.56～14.71 min（图1B），峰面积为1.4×106。 图1A 还显示了正离子模式下棉酚在保留时间为14.352 min时，其加合物[M＋H]＋的质荷比（m/z 519.202 4）、峰强度及相应MS/MS 光谱；图1B 还显示了负离子模式下棉酚在保留时间为14.646 min 时其加合物[M－H]－的质荷比（m/z 517.185 6）、峰强度及相应MS/MS 光谱。

图1 正离子模式（A）和负离子模式（B）下棉花根样本中代谢产物UPLC-ESI-MS 总离子色谱图Fig. 1 UPLC-ESI-MS TICs of metabolites occurring in cotton root under positive (A) and negative (B)ionization modes

2.3 代谢组数据有效性和可靠性

对2 个数据集的主成分分析结果（图2A、图3A） 显示， 样本数据都处于95%置信区间内，但根、茎、叶3 个组织能够明显独立分开，并且同一棉花组织近距离聚集；同时病原菌处理的棉花组织与相应健康对照也呈现明显分离趋势，同一处理能近距离聚集。 初步说明获得数据有效可信，植物组织间及不同处理间存在差异。

图2 正离子模式下根、茎、叶样本的主成分分析模型和正交偏最小二乘法判别分析模型Fig. 2 PCA model and OPLS-DA model of root, stem and leaf under positive ionization modes

图3 负离子模式下根、茎、叶样本的主成分分析模型和正交偏最小二乘法判别分析模型Fig. 3 PCA model and OPLS-DA model of root, stem and leaf under negative ionization modes

进一步采用OPLS-DA 法对不同组织样本分析，结果表明供试样本数据均处于95%置信区间内，同一组织样本数据在病原菌处理与相应健康对照间存在明显的分离趋势，同一处理样本近距离聚集（图2B～D、图3B～D），而且对OPLS-DA的置换检验表明建立的OPLS-DA 模型没有过度拟合（图2E～G、图3E～G）。 并且无论正离子模式下，还是负离子模式下，根、茎、叶3 个棉花组织的OPLS-DA 模型参数R2Y 均不低于0.995，Q2均不低于0.727（图2H 和图3H），说明建立的OPLS-DA 模型有效和可靠。 上述结果表明同一组织不同处理间存在明显的差异。

2.4 与大丽轮枝菌侵染相关的棉花代谢产物挖掘

2.4.1 大丽轮枝菌处理与健康对照间棉花差异代谢产物。 棉花根、茎、叶样本中代谢产物的OPLS-DA S-plot 结果（图4）表明，检测到的棉花代谢产物离子在模型中呈现S 型分布，说明同一棉花组织不同处理间部分代谢产物存在明显差异。根据OPLS-DA 模型计算的各离子VIP 值和不同处理间学生t 检验p 值进行了差异棉花代谢产物筛选，989 个离子的VIP＞1 和p＜0.05，其中正离子模式下检测到131 个离子（ESI＋离子），负离子模式下检测到858 个离子（ESI－离子）。 这989 个差异代谢产物中，59 个ESI＋离子和441 个ESI－离子存在于棉花根中，41 个ESI＋离子和323 个ESI－离子存在于棉花茎中，48 个ESI＋离子和342个ESI－离子存在于棉花叶片中（图5），其中9 个ESI＋离子和40 个ESI－离子同时存在于3 个棉花组织中。

图4 正、负离子模式下棉花根、茎、叶样本中代谢产物的OPLS-DA S-plot 图Fig. 4 OPLS-DA S-plots of metabolites presenting in root, stem and leaf under positive and negative ionization modes

图5 病原菌处理与健康对照间差异离子在不同棉花组织中分布情况Fig. 5 Distribution of differential ions between pathogen-treated tissues and healthy controls in different cotton tissues

2.4.2 与大丽轮枝菌侵染相关的重要棉花代谢产物。在上述989 个差异代谢产物离子中，576 个离子（82 个ESI＋离子和494 个ESI－离子）的峰强度在病原菌处理下较对照增加1 倍及以上或降低50%及以上（图6），详细离子信息列于附表2和附表3（印刷版省略，电子版参见本刊网站）。在这576 个显著变化离子中，461 个离子（33 个ESI＋离子和428 个ESI－离子）出现在棉花根部，77 个离子（20 个ESI＋离子和57 个ESI－离子）出现在茎部，72 个离子（34 个ESI＋离子和38 个ESI－离子）出现在叶部，其中仅有2 个ESI－同时出现在棉花根、茎、叶3 个棉花组织中。

与对照相比，病原菌处理的根部出现376 个离子（27 个ESI＋和349 个ESI－）的峰强度增加1倍及以上和85 个离子 （6 个ESI＋离子和79 个ESI－离子）的峰强度降低50%及以上，茎部出现49 个离子（11 个ESI＋离子和38 个ESI－离子）峰强度增加1 倍及以上和28 个离子 （9 个ESI＋离子和19 个ESI－离子）峰强度降低50%及以上，叶部出现31 个离子（19 个ESI＋离子和12 个ESI－离子）峰强度增加1 倍及以上和41 个离子（15 个ESI＋离子和26 个ESI－离子） 峰强度降低50%及以上。

2.5 与大丽轮枝菌侵染相关的重要棉花代谢产物鉴定

本检测中，锁定相对分子质量的实验误差为2.1×10－5，因此推定误差介于－2.0×10－5～2.0×10－5的匹配物质作为供试次生代谢产物的鉴定结果。 据以上576 个重要差异代谢产物m/z 计算出对应的所有可能准确相对分子质量，进一步计算与自建棉花代谢产物数据库的各物质准确相对分子质量的误差。 结果表明9 个ESI＋离子和68 个ESI－离子匹配47 个文献报道的棉花代谢产物， 分别占相应供鉴定离子数量的11.0%和13.8%，86.6%的离子没能得到鉴定。

2.5.1 正离子鉴定。 9 个被鉴定的ESI＋离子（离子 编 号205、545、721、794、916、1032、1223、1653和2966）对应11 个物质，被推定15 次，均属于萜类物质（表1）。 其中，6 个离子匹配唯一报道过的棉花代谢产物，5 个为杜松烷倍半萜 （半棉酚2个、6- 甲氧基棉酚2 个和6,6'- 二甲氧基棉酚1个），1 个为二萜类（赤霉素A4）；2 个离子各匹配2 个棉花代谢产物， 均为杜松烷倍半萜棉素和6-甲氧基半棉酚；1 个离子匹配5 个棉花代谢产物，为杜松烷倍半萜1 (10),4-cadinadien-2-ol、12- 羟基-β-石竹烯、氧化红没药烯、桉油烯醇和氧化石竹烯。

病原菌处理与对照相比，离子545（鉴定为赤霉素A4）峰强度仅在茎部减少72%，离子1032[1(10),4-cadinadien-2-ol、12- 羟基-β- 石竹烯、氧化红没药烯、桉油烯醇和氧化石竹烯]仅在叶部增加7.6 倍， 其他7 个离子均在根部增加3.2 倍以上，变化最大的为离子916（6-甲氧基棉酚），增加了105 倍。

2.5.2 负离子鉴定。 68 个被鉴定的ESI－离子对应了41 个物质，被推定89 次，其中53 个离子匹配唯一报道过的棉花代谢产物，13 个离子匹配2个棉花代谢产物，1 个离子匹配4 个棉花代谢产物，1 个离子匹配6 个棉花代谢产物（表2）。这41个物质分别属于杜松烷倍半萜 （出现频次51次）、黄酮（18 次）、碳水化合物（9 次）、二 萜（4次）、杂倍半萜（4 次）、脂肪族（1 次）、环法尼烷倍半萜（1 次）和酚类（1 次）；出现频次最多的物质为棉酚（17 次），其次为棉籽糖（6 次），儿茶酚、1,3,5-cadinatriene-3,9,10-triol 9-glucoside、赤霉素A13和1,3,5-cadinatriene-3,9,10-triol 10-glucoside各出现4 次，6,6'- 二甲氧基棉酚、6- 甲氧基半棉酚、6- 甲氧基棉酚、6- 脱氧半棉酚和棉素各出现3 次，白矢车菊素、青榆烯D、紫云英苷、异紫云英苷和半棉酚酮各出现2 次， 其他25 个物质分别仅出现1 次（图7）。

图6 病原菌处理较健康对照峰强度增加1 倍及以上或降低50%及以上的差异离子在棉花组织中分布情况Fig. 6 Distribution of distinguished differential ions of peak intensity increased by ≥1 fold or decreased by ≥50%in pathogen-treated cotton tissues compared to corresponding healthy controls

病原菌处理与健康对照相比，离子43（鉴定为6- 脱氧半棉酚） 峰强度在茎部增加1.2 倍，叶部减少79%；离子499（半棉酚酮）仅在根部减少57%，其他66 个离子均在根部表现增加，其中30个离子推定的物质的峰强度均增加10 倍以上[脱落酸（离子编号1476）、1,3,5-cadinatriene-3,9,10-triol 10-glucoside 和1,3,5-cadinatriene-3,9,10-triol 9-glucoside（2274）、6-脱氧半棉酚（1056）、6- 甲氧基棉酚 （1090、1679、2724）、6,6'- 二甲氧基棉酚（560、3454）、紫云英苷和异紫云英苷（1036）、儿茶 酚（1104、2712）、棉 籽 菁（1325）、棉 酚（823、1060、1061、1202、1203、1789、2217）、 棉 紫 色 素（2617）、半棉酚（494）、青榆烯A（175）、青榆烯C（40）、青榆烯D（506）、白矢车菊素（469、1719）、棉籽糖（543、1555、1556、1799）]。

图7 负离子模式下超高效液相色谱电喷雾质谱推测鉴定的重要差异代谢物种类及检出频次Fig. 7 Types and detection frequency of distinguished differential metabolites putatively identified by UPLC-ESIMS under negative ionization mode

表1 正离子模式下超高效液相色谱电喷雾质谱推测鉴定的棉花组织提取物中重要差异代谢物Table 1 Distinguished differential metabolites in cotton tissue extracts putatively identified by UPLC-ESI-MS under positive ionization mode

表2 负离子模式下超高效液相色谱电喷雾质谱推测鉴定的棉花组织提取物中重要差异代谢物Table 2 Distinguished differential metabolites in cotton tissue extracts putatively identified by UPLC-ESI-TOF/MS under negative ionization mode

表2 （续）Table 2 (Continued)

表2 （续）Table 2 (Continued)

表2 （续）Table 2 (Continued)

3 讨论

3.1 棉花代谢组分析时质谱检测模式选择

本研究在棉花代谢组分析中，采用正离子模式（ESI＋）和负离子模式（ESI－）对所有供试样本中代谢产物进行了检测， 分别获得了4 572 个ESI＋离子和3 960 个ESI－离子。 经多元统计分析， 筛选到VIP＞1 和处理间峰强度差异显著（p＜0.05）的ESI－离子858 个，为ESI＋离子（131个）的6.5 倍，在根、茎、叶组织中2 种模式下差异离子比例分别为7.5、7.9 和7.1。 进一步分析发现，病原菌处理较对照离子峰强度增加1 倍及以上或降低50%及以上的差异离子中，ESI－离子数量为494 个，为ESI＋离子总数（82 个）的6.0 倍，在根、茎、叶组织中2 种模式下差异离子比例分别为13.0、2.9 和1.1。 以上结果表明，采用质谱检测时，2 种检测模式检测到的棉花代谢产物离子数量相差不大，但在进一步挖掘处理间差异代谢产物时，ESI－离子的数量明显大于ESI＋离子，并且在棉花根、 茎、 叶组织中也表现同样的规律。Moco 等[34]在利用液相色谱- 质谱分析番茄代谢组时，发现不同离子模式检测下番茄代谢产物的离子信号强度存在明显差异。 因此，建议在采用UPLC-ESI-MS 进行棉花代谢组学分析时，选择负离子模式检测方法。

3.2 不同处理间棉花差异代谢产物分布

基于VIP＞1 和处理间离子峰强度t 检验p＜0.05 挖掘出大丽轮枝菌接种处理与健康对照间的差异代谢产物，在根、茎、叶组织中分别分布500 个离子（59 个ESI＋离子和441 个ESI－离子）、364 个离子（41 个ESI＋离子和323 个ESI－）、390 个离子（48 个ESI＋离子和342 个ESI－离子），比例为1.37∶1∶1.07。 这一结果表明，差异代谢产物在根部分布比例较高，在叶部和茎部分布比例较低且差异不大；进一步分析发现，病原菌处理较对照离子峰强度增加1 倍及以上或降低50%及以上的重要差异代谢产物，在根、茎、叶各组织中，分别分布461 个离子（33 个ESI＋离子和428 个ESI－离子）、77 个离子（20 个ESI＋离子和57 个ESI－离子）、72 个离子 （34 个ESI＋离子和38 个ESI－离子），比例为5.98∶1∶0.94。 这一结果表明，病原菌处理与健康对照间重要差异代谢产物在根部分布数量也最高，远远高于叶部和茎部。 综上所述，在棉花苗期大丽轮枝菌接种8 d时，病原菌处理和健康对照间重要差异代谢产物的分布具有一定的组织偏好性， 主要存在于棉花根部。 对造成此种现象的原因，应进一步进行研究。

3.3 代谢产物鉴定

LC-MS 分析技术是代谢组分析的最高效和最灵敏的方法，但LC-MS 系统的多样性以及LC较低的保留时间再现性，严重限制了单一优化分析方法的建立， 妨碍实验室间LC-MS 色谱图的比较。 同时，缺少将LC-MS 质谱数据自动转换为（推定的）植物代谢物的高效软件工具。 这意味着对大量信号数据集的分析只能在现有的化学数据库（如SciFinder、Pub-Chem、Massbank 或Dictionary of Natural Products）中进行手动搜索[34]，而这些数据库的信息来自一般的化学物质，在化合物来源上缺乏与植物关联，导致植物代谢组鉴定时推定的物质种类存在多种可能性，同时因为手动搜索，筛选效率也受到极大限制。 因此，如何实现代谢产物的准确鉴定成为代谢组分析中的重要难题。 在线XCMS 软件的出现，在一定程度上解决了不同型号LC-MS 系统采集的数据处理，实现特征离子检测、保留时间校正、对齐、注释、统计分析和数据可视化处理的自动化，为完整的非目标元组工作流程提供了解决方案[35]。同时，该技术能自动搜索和匹配METLIN 串联质谱数据库，实现代谢产物高通量和高效鉴定[36]。 本研究结果表明， 通过在线XCMS 软件进行了代谢产物鉴定，发现匹配物质与报道的棉花代谢产物存在较大差异，所以该软件在针对具体植物的代谢产物进行鉴定时存在较大的局限性。 为保证鉴定的代谢产物均为棉花代谢产物，本研究建立了棉花代谢数据库，根据LC-ESI-MS 分析中ESI＋和ESI－模式下加合物存在的一般规律， 利用MATLAB 软件计算程序计算出检测到的代谢产物离子m/z对应的所有可能准确相对分子质量，进一步计算与代谢产物数据库中各物质准确相对分子质量间的误差，根据锁定的相对分子质量（甲酸钠）检测误差设定误差阈值，以小于此阈值推定的匹配物质作为供试代谢产物的鉴定结果，保证了供鉴定的物质匹配的仅是棉花代谢产物，在一定程度上解决了物质鉴定的准确性。 但鉴定结果表明仍有86.6%的离子未能得到鉴定。 这可能与本研究建立的棉花代谢产物数据库库容量小有关。 所以，应进一步加强研究和建设棉花次生代谢产物数据库。

3.4 病程相关的代谢产物

据文献报道，在大丽轮枝菌与棉花早期互作（接种后1～4 d）中，脱氧半棉酚、半棉酚、棉酚、半棉酚酮、杀实夜蛾素（H1、H2、H3和H4）及其甲氧基和二甲氧基衍生物等倍半萜类物质、黄酮类物质、酚类物质可在抗病棉花植株中大量出现[31,37]，而且倍半萜类物质合成途径的分子调控研究是棉花分子抗病育种工作的重点之一[38]。

本研究结果表明，经本方法鉴定，大丽轮枝菌处理与健康对照棉株间77 个重要差异次生代谢产物离子（9 个ESI＋离子和68 个ESI－离子）推定到匹配物质48 个，在供鉴定离子（576 个）中占比仅为13.4%。 被鉴定的ESI＋离子对应11 个物质，被推定15 次，均属于倍半萜类物质；被鉴定的ESI－离子对应41 个物质， 被推定物质89 次，其中倍半萜类56 次（杜松烷倍半萜51 次、杂倍半萜4 次、环法尼烷倍半萜1 次）、二萜类4 次，黄酮类18 次、碳水化合物9 次、脂肪族1 次和酚类1 次。 该结果表明在大丽轮枝菌与棉花互作过程中，这些物质在棉花体内的积累量发生了显著变化，与健康对照相比，除二萜类物质赤霉素A4（在茎部减少72%）外，其余在棉花体内积累量均增加1 倍以上。 这与文献报道[31,37]一致。

本研究鉴定出的酚类物质（咖啡酸）、黄酮类物质（紫云英苷、异紫云英苷、五桠果素、儿茶素、棉花素-8- 鼠李糖苷、棉籽菁、草质素-7- 葡萄糖苷、白矢车菊素、槲皮素-3’- 葡萄糖苷、槲皮素-3-葡萄糖苷、槲皮素-7- 葡萄糖苷和α,2',3,3',4,4',6-庚羟基查耳酮2'- 葡萄糖苷），在大丽轮枝菌与棉花互作相关文献中未见报道；鉴定出的碳水化合物（蜜二糖、蔗糖、蔗糖-6- 磷酸酯）和脂肪族物质（1- 三十四烷醇），在病原菌- 植物互作有关的文献中也未见报道。 另外，本研究中获得的大丽轮枝菌与棉花互作重要差异次生代谢产物中86.6%的离子未获得鉴定，这些物质中可能有大丽轮枝菌与棉花互作过程中新的病程相关代谢产物。 这些物质是否影响及通过何种方式影响棉花对黄萎病的抗病性，应进一步进行验证和深入研究。

4 结论

UPLC-ESI-MS 负离子检测模式比较适合棉花代谢组分析。 这些重要次生代谢产物的差异是大丽轮枝菌与棉花互作的结果，与棉花黄萎病的病程相关。 除半萜类外，新发现的黄酮类、酚类、碳水化合物、脂肪族以及未获得鉴定的物质可能在棉花黄萎病病程中发挥重要作用，为深入解析棉花黄萎病机制提供了重要线索。