氧化石墨烯生物传感器应用研究进展

刘海燕，白云峰，秦 君，李 江，冯 锋

（山西大同大学有机化学研究所，山西大同 037009）

1 氧化石墨烯及其特点

单层氧化石墨烯（graphene oxide,GO）是石墨经化学方法强氧化后再剥离得到的。GO 表面含有羟基、环氧基、羧基、苯环、内酯基及醌基等多种功能团。其中亲水性的极性含氧基团不仅使GO在溶剂特别是水中呈现良好的分散性，而且使GO 能稳定地分布在不同的基质上。同时GO在能量转移体系中，可作为优良的能量受体，能量可以从染料转移到GO上，染料的荧光遂被猝灭。另外，GO不仅可以通过表面化学增强机制增强拉曼信号，而且具有类似过氧化物酶的催化活性。GO 还具有电活性特征，可实现可逆的电还原和氧化。基于GO 的上述特性，GO 被越来越多地应用到生物传感器中对核酸、小分子蛋白质进行检测。

2 GO与核酸的作用

因GO 表面积大，可通过π-π堆积作用结合单链DNA（ssDNA），并且ssDNA的结合力明显强于双链DNA（dsDNA）。Lu 等通过研究发现，GO 可以与结合了荧光团的ssDNA进行结合并猝灭其荧光，但是对于dsDNA 或者ssDNA 的二级和三级结构作用较小[1]。Fan 等对GO 与不同类型DNA 的相互作用进行了分子动力学模拟[2]。Wu等通过研究发现，短链DNA结合在石墨烯上的速度更快，结合力更强[3]。Yang小组对ssDNA结合在GO上的能力和稳定性进行了研究。结果表明，ssDNA 可以稳定结合在GO的表面且这种结合可以有效地防止DNA 被酶切[4]。基于上述研究结果，ssDNA/ssRNA-GO 被广泛地应用于生物传感器设计中。

3 基于GO的生物传感器

3.1 基于GO的荧光生物传感器

GO 作为荧光猝灭剂，因其具有两亲性，所以具有很强的吸附能力，不仅可以通过π-π作用力吸附含芳香环的疏水性分子，也可以通过氢键吸附亲水性物质。如果吸附的物质连接有荧光染料，GO 与燃料之间可以进行能量转移，从而导致荧光猝灭，背景信号降低。在利用DNA 或RNA 探针的传感器中，标记有荧光基团的DNA 或RNA 探针首先会被吸附在GO表面引起荧光猝灭。接着靶分子的添加，会使核酸被解吸附，荧光团与GO 距离增大，荧光恢复。基于此原理，利用荧光基团标记的互补核苷酸或适配体作为识别单元的GO荧光传感器被广泛应用于DNA、蛋白质和其它小分子的检测。

3.1.1 基于适配体的GO荧光传感器（FRET）

核酸适配体是可以通过折叠成不同的二级结构和三级结构实现与靶标分子特异性结合的DNA或者RNA。它是通过指数富集的配基系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）筛选获得的碱基数一般为20～100 个左右的单链寡聚核苷酸。通过修饰适配体，Apiwat 等利用GO 构建了一个诊断和监测糖尿病人糖化白蛋白的适配体荧光传感器。该方法利用的是一个包含发夹结构的并且可以与糖尿病标志物糖化白蛋白结合的适配体。经过条件优化，该传感器的最低检测限为50 μg/ mL[5]。以此为基础，Zhang 等将尺寸效应引入到传统适配体传感器中，通过控制GO的纳米尺寸来提高传感器性能构建了一个可进行精确控制的新型荧光传感器[6]。

适配体荧光传感器的研究不仅集中在分子水平的检测，而且已延伸到细胞水平的应用。利用适配体和GO构建的荧光传感器可以有效捕获并识别多种类型循环肿瘤细胞而且可从多种类型的肿瘤细胞中捕获循环肿瘤细胞，具有良好的选择性[7]。

3.1.2 基于碳点和上转换发光材料标记的GO荧光传感器

碳点（C-dots,CD）因易合成、反应过程简单和光稳定性高，被认为是一种良好的荧光标记染料。将CD和上转换纳米粒子应用于传感器中可克服传统荧光染料成本高、光稳定性差等缺点。用CDs标记的寡脱氧核糖核苷酸和GO 构建的Hg2+的传感器可实现对Hg2+高灵敏度和高选择性检测，最低检测限达到2.6 nmol/L[8]。

稀土上转换发光材料在光激发时，不仅可以发射比激发波长短的光，而且其吸收的光子能量低于发射的光子能量。Alonso-Cristobal 等利用GO 和上转换材料构建了一个传感器用于DNA 检测。目标DNA 存在时，可使DNA 功能化的上转换纳米粒子远离GO并发出强荧光[9]。

3.1.3 基于非共价标记的GO荧光传感器

金属纳米团簇因其荧光性质可以被用来组装非共价标记的荧光传感器。其中银纳米簇因其固有的高量子产率和光稳定性被广泛使用。利用“Y”状DNA 模板的臂捕获银离子组成纳米团簇状结构和与GO 构建的微小RNA（MicroRNA,miRNA)传感器，在无目标miRNA时，“Y”状DNA中的单链环状部分可以被GO 吸附在表面，荧光强度很低。但存在目标miRNA 时，目标miRNA 会因与“Y”状DNA形成了双链而不被GO吸附，导致荧光恢复[10]。

用脂质体包裹卟啉作为探针对靶酶的膜孔转化活性进行检测。由于靶酶可以将脂质体膜破坏，卟啉泄漏，并被GO 吸附，使得荧光猝灭。利用手性钌配合物与GO反应设计的适配体传感器可对凝血酶进行高选择性和高灵敏度的检测[11]。

3.1.4 基于生物酶的GO荧光传感器

利用生物酶的循环信号放大法如滚环扩增法、聚合酶链式反应、连接酶链反应等可以使荧光信号强度显著增强。Ju 等构建了一个利用核酸外切酶III进行信号放大的免标记传感器用于对DNA检测[12]。

基于Nicking核酸内切酶和GO构建的信号放大型荧光适配体传感器利用裂开型分子信标，对生物样品中的血管内皮生长因子和ATP 进行高灵敏度检测，检测最低限分别达到1 pmol/L和4 nmol/L[13]。Nicking 核酸内切酶的使用，使传感器中适配体在信号放大过程中更加稳定，并且降低了背景假信号。

脱氧核酶（DNAzyme）是一类由DNA 组成的酶。1994 年，Breaker 和Joyce 研究发现脱氧核酶可以识别底物核酸的特殊序列并且催化水解反应[14]。Zhao 等首次通过有机染料标记的脱氧核酶进行底物杂交构建了一个用于检测Pb2+的GO 传感器[15]。利用RNA 裂解嵌合DNA 酶（RCDzyme）构建的基于GO 的酶信号循环放大的传感器，用富G 序列替代铀酰特异脱氧核酶的部分序列可用于铀的检测。脱氧核酶不仅作为目标识别元件，还是信号扩增的引物。当铀存在时，脱氧核酶的底物链被裂解并与另外一个底物链杂交，从而引起重复裂解循环。富含鸟嘌呤的寡核苷酸片段形成的G-四链体会与NMM结合，从而导致荧光大幅增强。利用GO 吸附游离ssDNA和NMM后，最低检测限可达到86 pmol/L[16]。

3.2 基于GO的SPR传感器

与传统利用金属薄膜的SPR传感器相比，石墨烯材料或其衍生物与金属一起可引起更显著的SPR信号变化[17]。石墨烯材料或其衍生物可提高SPR传感器对折射率的灵敏度。石墨烯作为一种非等离子体材料，可以与金（Au）、银（Ag）等等离子体材料结合。结合后，当电荷从多孔石墨烯转移到表面时会引起较大的SPR 信号变化[18]。Xue 团队对SPR 传感时GO和染色剂的反应进行研究，发现GO氧化态变化会影响其反射特性从而影响检测的灵敏度[19]。

3.2.1 基于共价结合的SPR传感器

因GO与蛋白质具有强共价结合能力，GO片层可作为媒介被用于蛋白质结合程度的实时监测。利用GO 薄膜构建传感器对胎牛血清进行检测，最低检测限低至100 ng/L[20]。通过肺癌标志物细胞角蛋白-19(KRT-19)与固定在羧基修饰的GO（(GOCOOH)）芯片上的KRT-19受体结合构建的易组装、高选择性、高灵敏度的SPR 传感器，可实现对非小细胞肺癌的诊断检测[21]。Zhang 等利用金纳米棒修饰的GO构建了检测转铁蛋白的传感器。通过转铁蛋白浓度的检测可对急性肝炎、贫血、妊娠、风湿、恶性肿瘤和急性白血病进行辅助诊断[22]。

3.2.2 基于GO的LSPR传感器

GO 不仅可使传感器的检测灵敏度增强还可防止电化学LSPR 传感器基底被氧化。利用rGO/Ag NPs 构建的气敏传感器，其气体诱导引起的等离子体激元移动及电导率响应变化均高于单独使用AgNPs 的传感器。利用GO 与AuNPs 构建的LSPR传感器中，GO 被用来固定DNA 分子，而AuNPs 可增强SPR 信号，实现了对miRNA 和腺苷的高灵敏度检测[23]。

3.2.3 基于GO纳米复合材料的SPR传感器

利用GO合成的纳米复合物在生物反应的检测中具有高灵敏度。Kamali 等用化学还原法合成了Ag-GO 纳米复合材料,对多巴胺、抗坏血酸和尿酸的光强检测的最低限分别为49、634 和927 nmol/L，基于相位检测的最低限分别为30 nmol/L、1.64μmol/L和2.15 μmol/ L[24]。将PDA-Ag@Fe3O4/rGO (Polydopamine-Ag@Fe3O4/reduced graphene oxide）构建三明治结构的IgG 传感器，灵敏度远高于传统金芯片，检测范围为0.019～40.00 μg/mL[25]。

3.2.4 基于光纤/光纤光栅的SPR传感器

Wang等利用GO和羊抗人IgG通过镀银聚合物包覆石英光纤构建传感器对人IgG 进行了检测，最低检测限达到0.04 g/ L[26]。利用GO 作为传感元件，并用光纤光栅来增强SPR 光线强度，灵敏度是传统金膜SPR传感器的2.5倍[27]。

3.3 基于GO的SERS传感器

GO 是一种具有拉曼活性的探针分子，具有特征性的拉曼光谱。GO 可通过吸附在表面的拉曼探针的化学增强效应来增强拉曼信号。基于上述特点，GO 被认为是一种良好的表面增强拉曼散射的基质。

3.3.1 GO作为拉曼活性探针分子

GO 与金属纳米粒子结合可以增强拉曼信号。贵金属AuNPs常被用来与GO结合作为增强拉曼散射的细胞成像剂，但该复合物的合成过程比较复杂。2015 年，Kim 等报道了用GO 作为金的还原剂和稳定剂实现了简单地一锅法合成用于细胞成像剂的Au@GO纳米胶体粒子的方法[28]。

3.3.2 GO作为SERS的基质

利用GO复合结构对全血中阿尔茨海默病生化标志物进行免标记、高选择性分离检测的拉曼生物传感器，通过将抗体与GO 结合后增强拉曼信号并利用金壳进行协同增强来对靶标进行分离和富集[29]。

3.4 基于GO的电化学传感器

GO 具有可逆电氧化还原的电活性特性，而还原氧化石墨烯（rGO）有跟石墨烯相似的低电荷转移电阻和良好的电化学性能。所以GO/ rGO 可用来构建电化学生物传感器。基于GO的电化学传感器可用来检测酶活性、DNA、蛋白质和癌细胞。

3.4.1 利用rGO 作为电化学活性分子进行富集的电化学传感器

当rGO附在电极上时，会因电化学反应产生电化学信号。2015 年，Chen 等利用rGO 设计了一个灵敏的细胞凋亡检测体系。该体系将N端乙酰化肽基质固定在金电极上。当来源于凋亡细胞的半胱天冬酶-3存在时，基质的活性胺端被水解释放，然后与rGO结合。其中亚甲蓝可以通过π-π与rGO相互作用，从而放大信号。利用该传感器系统对人肺癌细胞凋亡情况进行检测，检测到的细胞凋亡的最低限为0.06 ng/L[30]。

3.4.2 利用rGO合成复合材料的电化学传感器

为了提高基于GO/ rGO 的电化学生物传感器的性能，有学者提出用导电材料来制备复合材料。Liu 等人设计了一种利用GO 制备复合材料的放大型电化学发光传感器对五氯苯酚进行高灵敏度检测[31]。将无机纳米粒子与rGO结合后构建的电化学传感器利用ssDNA/AuNP/ rGO 修饰的玻璃碳电极对靶DNA 实现了高选择性检测[32]。另外，由壳聚糖、鱼骨状的Fe2O3和还原GO组成的复合物具有优良的电催化活性，被用来构建对没食子酸进行高灵敏度的检测的传感器[33]。Wei 团队利用草鱼皮胶原蛋白GO复合物与适配体设计了电化学传感器对多巴胺进行了检测，最低检测限达到0.75 nmol/L[34]。利用氨基化还原氧化石墨烯（amino-rGO）对丝网印刷碳电极（SPCE）进行修饰后构建的溶菌酶传感器，用交流阻抗法（EIS）和差分脉冲伏安法（DPV）进行检测的最低限分别为2.1和4.2 fmol/L[35]。

3.4.3 基于特异性探针修饰的电化学传感器

为了增强传感器的选择性，Li等将分子印迹法应用到电化学传感器设计中，并研制了一个高灵敏度和高选择性的晚霞黄电化学传感器。与传统传感器相比，该传感器缩短了结合时间，并减弱了导电性。该体系对食品添加剂晚霞黄的最低检测限为2.0×10-9mol/L[36]。通过利用GO/AuNPs/抗体修饰的电极设计的双信号电化学免疫传感器，可以对来源于与抗体共轭结合的AgNPs/碳纳米复合材料的直接氧化电流和来源于对苯二酚的间接还原电流进行监测从而实现对IgG 的检测，且利用此传感器可对血清中的人IgG 进行检测，最低检测限可达到0.001 μg/L[37]。在此基础上，Ali等构建了由介孔rGO 和氧化镍组成的阿朴脂蛋白B100 功能化的纳米复合材料用于对低密度脂蛋白分子进行高灵敏度检测[38]。

3.5 基于GO的比色传感器

与天然酶相比，GO 具有更高稳定性的过氧化物酶样活性。GO 可以为过氧化物酶样物质的组装提供表面而提高稳定性和催化活性。探针修饰的GO 可被用来建立靶向特异性的比色生物传感器。在过氧化物酶底物H2O2和四甲基联苯胺共同存在时，GO可利用氧化型四甲基联苯胺产生蓝光。

基于GO的比色生物传感器主要由复合过氧化物酶类的纳米粒子组成，以提高传感器的灵敏度。2015 年，Zhang 等提出了一种基于靶分离和GO/PtAuNP 催化活性的超灵敏、选择性的三磷酸腺苷（ATP）生物传感器。ATP 既与GO/PtAuNP 修饰的适配体结合又与连接了磁珠的适配体结合。经结合形成的复合物经过磁分离后，可与H2O2和四甲基联苯胺反应呈现蓝色。该传感器的最低检测限为0.2 nmol/ L。另外，用肉眼可以清晰地分辨出50 nmol/L的颜色变化[39]。Chau等设计了一个基于Pt/rGO的检测特定DNA序列的比色传感器。当靶DNA 与Pt/rGO 上的探针杂交时，纳米复合材料会因盐诱导而聚集。离心后，剩余的纳米复合材料呈现蓝色[40]。Yang 团队利用IrO2/rGO 纳米复合材料构建了一个检测生物硫醇的比色传感器，实现对生物硫醇的快速、高灵敏检测[41]。

4 展望

GO 作为一种良好的生物材料，因其具有较好的生物相容性、巨大的比表面积、优良的光学性质和丰富的活性位点而备受关注，已被广泛应用于各类生物传感器。但将GO应用于传感器仍有以下问题有待进一步研究和改进：首先，GO 的制备方法需要进一步改进，在制备工艺上有较大的提升空间；另外，基于GO 的传感器在细胞中的应用及其作用机理、GO 对细胞的长期毒性及其代谢途径有待进一步探索。总之，随着对GO 及其复合材料的深入研究，GO 将被更广泛地应用于生物传感器构建，发挥其举足轻重的作用。