山羊痘病毒检测方法分析

王李辉，刘泽华

（1.平顶山市动物疫病预防控制中心，河南 平顶山 467000；2.宝丰县动物疫病预防控制中心，河南 宝丰 467400）

1 山羊痘病毒的简要概述

山羊痘由山羊痘病毒引起的，是一种急性、热性接触性传染病。其特征为皮肤和可视黏膜出现丘疹和疱疹[1]。山羊痘病毒多发于细毛羊、山羊、绵羊与羔羊之间，其容易引起包括印度羊皮炎与肯尼亚绵羊痘在内的诸多其他恶性痘病。感染山羊痘病毒的病羊，通常会出现高烧发热，体温在短时间内可迅速升高至40℃至42℃，食欲减退、体型消瘦的症状。部分病羊还会出现皮肤水肿与淋巴结肿大的症状，感染该病毒的母羊则会出现产乳量骤减的情况。还有部分病羊在感染山羊痘病毒后会出现无毛的临床表现，其不仅对山羊生长发育与生产性能造成不利影响，同时也极大影响了羊毛与羊皮制品的品质。根据相关研究数据显示，成年羊感染该病毒后的死亡率超过42%，羔羊感染该病毒后致死率更高，几乎达到100%。

2 山羊痘病毒的常用检测方法

2.1 病原学检测方法

随着近些年国内外研究人员逐渐加大了对山羊痘病毒及其检测的研究力度，目前在检测该病毒中已经出现了许多具有一定准确度和可操作性的检测方法。其中之一即为病原学检测法，例如可通过对感染该病毒的病羊皮肤组织进行采集提取，或是可选择将病羊鼻腔分泌物、高烧发热期间内的血液、出现肿大情况的淋巴结作为病料进行采集，而后进行病毒分离与电镜观察即可进行准确检测。例如有研究人员通过选择疑似感染山羊痘病毒的病羊皮肤疱疹以及水疤作为病料进行采集，而后接种BHK-21传代细胞盲传3代。通过使用电子显微镜进行认真观察后，可明显发现其出现细胞病变，且其存在一定规律性。而后使用这一BHK-21细胞培养物对日龄为9d的鸡胚绒毛尿囊膜进行接种，当传代次数越来越多时，发现痘斑病变出现也愈发频繁。在电镜观察中，研究人员通过分别使用硝酸铅、醋酸铅对培养得到的材料切片进行双重染色，而后认真观察病毒粒子，可发现其初期呈现为大小在250nm至350nm之间的卵圆形，被膜内含有较高电子密度，均匀物质在被膜内的占比相对较大。中后期病毒粒子直径明显减小，且存在较高致密性，此时电子密度呈不均匀性，通过观察可将病毒粒子中央有核酸芯髓，其呈现出类似哑铃的形状，同时还有两个侧小体。

2.2 血清学检测方法

血清学检测法也是当前在山羊痘病毒检测中常用的一种方法，按照具体类型，可将该方法细分成病毒中和与免疫琼脂扩散试验、酶联免疫吸附与免疫荧光抗体试验等等。例如在早期使用免疫琼脂扩散试验法进行检测时，有研究人员通过先反复3次冻融盲传4代后感染BHK-21细胞培养物，而后将其连同山羊痘标准阳性血清，一起进行免疫琼脂扩散试验，发现有白色沉淀线出现。对比正常细胞沉淀抗原以及PBS可知，其不存在沉淀线，故而有效达到检测山羊痘病毒的效果。但后期检测人员也发现，在使用该检测法时，如果选取感染山羊痘病毒的病羊皮肤黏膜痘疹以及感染细胞培养物作为病料，则病料中含有较多病毒粒子的，其阳性检出率反而相对较低。因此在使用血清学相关理论与原理下，检测人员开始逐步将免疫荧光抗体试验、血凝试验等应用在山羊痘病毒检测中，并获得了良好的检测效果。如通过使用专门的荧光抗体检测设备，当采集病羊痘皮肤痘疹作为病料并将其制作成切片，与感染细胞抹平一起进行免疫荧光抗体试验时，利用该检测设备，若发现存在明显的特异性荧光，且荧光颜色呈黄绿色，即代表患病羊确实感染山羊痘病毒。

3 分子生物学检测

在山羊痘病毒检测中另一种常用检测方法即为分子生物学检测法，其主要包括PCR检测法、荧光定量PCR检测法等等。以PCR检测法为例，该检测法中PCR指的就是聚合酶链式反应，主要利用体外酶促进合成特异性DAN。使用该种检测方法可以在短时间内使目的DNA得到有效扩增，对于分离和克隆基因等具有一定优势效用。由于山羊痘病毒从本质上看，属于一种双股DNA病毒，因此有研究人员通过对山羊痘病毒DNA进行提取，并依照其P32基因对引物进行合理设计，发现使用PCR检测法能够快速、准确地检测出山羊痘病毒株，对于山羊痘疹样本当中的山羊痘病毒DNA也同样具有较高的检出率。在该检测技术的进一步发展下，出现了多重PCR检测法，可一次性对多种疾病进行有效检测。例如有研究人员针对绵羊痘与山羊痘病毒的基因组序列，分别设计两对引物，每一对引物均具有较高特异性。在进行条件优化后，建立起相应的双重PCR检测法，可同时快速、精准地完成山羊痘与绵羊痘病毒检测。

4 结语

总之，目前在山羊痘病毒检测中，检测方法技术多种多样，包括建立在病原学、血清学以及生物分子学基础上的检测方法。其对于检测山羊痘病毒均具有一定的应用优势，未来相关工作人员还需继续加强对山羊痘病毒检测技术的深入探究，探索更多高效、灵敏度与准确度更高、操作便捷、成本低廉的检测技术，以此获得更理想的检测效果。