氨基酸分析仪测定蜂蜜氨基酸组成的研究

蚁碧珍 王锦源

摘 要：本文采用盐酸水解法处理蜂蜜樣品，通过日立L-8900氨基酸分析仪分析6种不同品种蜂蜜的16种氨基酸。结果显示：6种蜂蜜的总氨基酸含量在0.106 7～0.194 9 g/100 g，氨基酸组成基本一致，通过本方法检测蜂蜜中氨基酸的含量，并可用于初步判断蜂蜜中是否添加非蛋白成分。因此，氨基酸含量和氨基酸比值可为建立系统的氨基酸监测技术体系提供理论依据。

关键词：蜂蜜;氨基酸;氨基酸分析仪

Abstract：Hydrochloric acid hydrolysis method was used to treat honey samples. Sixteen kinds of amino acids of six different varieties of honey were analyzed by Hitachi L-8900 amino acid analyzer. The results showed that the total amino acid content of six kinds of honey ranged from 0.106 7 to 0.194 9 g/100 g， and the amino acid composition was basically the same. The method of amino acid composition could be used to identify honey. Therefore， the content and ratio of amino acids can provide theoretical basis for the establishment of a systematic monitoring system of amino acids.

Key words：Honey; Amino acid; Automatic amino acid analyzer

中图分类号：S896.1

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，经自然发酵而成的黄白色黏稠液体，被誉为“大自然中最完美的原料与营养食品”[1]。蜂蜜富含糖类、蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素等营养物质[2]，具有美容养颜、通便等生理功能。蜂蜜因其高营养价值与生理功能，越来越受到消费者的追捧，近年来，许多不良商家为了降低蜂蜜的成本，增加利润，蜂蜜掺假现象越发严重。因此，有必要建立有效的手段对蜂蜜品质进行监控。蜂蜜中蛋白质和氨基酸含量与其营养功能密切相关[3]。由于氨基酸是组成蛋白的基本单位，相同类型的物质蛋白和氨基酸具有相似性，通过检测蜂蜜中的氨基酸，分析其中的规律并建立质控方法。本文采用氨基酸自动分析仪设备测定不同产地蜂蜜中的氨基酸组成，该方法具有操作简单、灵敏度高、专一性强、可适用性强等特点[4-7]。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：日立牌L-8900型号氨基酸自动分析仪、HHS-2型号电热恒温水浴锅、电热恒温干燥烘箱、AG204电子天平等。

试剂：浓盐酸、茚三酮、苯酚等，均为分析纯。

1.2 色谱条件

进样量20 μL，每个样品分析时间约55 min。色谱柱规格：4.6×60 mm;填料：3 μm磺酸型阳离子树脂分离柱;泵1流速：0.40 mL·min-1;泵2流速：0.35 mL·min-1;检测器温度：135 ℃;柱温：57 ℃;检测波长：第一通道570 nm，第二通道440 nm。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

准确称取0.5 g（精确至0.000 1 g）的蜂蜜样品于水解管中，加入6 mol·L-1的盐酸10～15 mL，加入3～4滴新蒸馏苯酚，然后将水解管放入冷冻剂中，冷冻3～5 min，接着抽真空。将水解管接到真空泵的抽气管上，抽真空（接近0 Pa），并充入高纯氮气;再抽真空然后充氮气，重复3次后，需在充氮气状态下封口，将已封口的水解管放在（110±1）℃的恒温干燥箱内，水解22 h后，取出冷却。

打开水解管，然后将水解液过滤后，水解管用去离子水多次冲洗，将水解液全部转移到50 mL容量瓶内，并用去离子水定容。吸取滤液2 mL于50 mL烧杯中，（标明温度）水浴蒸干，残留物用1～2 mL水溶解，再干燥，反复进行两次。最后通过混匀压滤10 mL pH为2.2的缓冲液溶解，以供仪器测定用。

1.3.2 成分定量分析

制备上机测定用的氨基酸标准液：准确吸取0.160 mL的混合氨基酸标准，然后用pH2.2的缓冲液稀释到5 mL，该标准稀释液浓度为1.6 nmol/20 μL。以外标法通过氨基酸自动分析仪测定试样溶液的氨基酸含量。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

精确吸取天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、赖氨酸（Lys）、L-胱氨酸（L-Cystine）和L-丝氨酸（L-Cystine）18种氨基酸混合标准溶液（2.5 μmol·mL-1）160 μL加到5 mL的容量瓶中，再用0.02 mol·L-1盐酸溶液进行定容至刻度，运用氨基酸分析仪进行检测分析，用测出的峰面积以及浓度绘制标准曲线，得到的线性回归方程。其中16种氨基酸相关系数R2均为1.000 0。仪器噪音水平为224.3，其最低检出限为0.70 pmol，见表1。

2.2 仪器精密度

由表2可知，将氨基酸标准溶液配制成1.6 nmol/20 μL，然后连续进样6次，16种氨基酸含量的相对标准偏差在0.12%～1.15%，表明精密度良好，结果是符合该仪器要求。

2.3 试验方法的精密度

取适量的检测蜂蜜样品，按照1.3的方法处理，分别测定不同蜂蜜样品的氨基酸含量，结果见表3。蜂蜜中氨基酸的平均回收率在91.0%～95.3%，RSD在0.00%～1.07%，均在允许范围内，结果较好。

2.4 蜂蜜中氨基酸成分分析

对蜂蜜样品进行酸水解，通过氨基酸分析仪对天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）和赖氨酸（Lys）16种氨基酸进行测定，并算出总氨基酸含量。图中脯氨酸用VIS2（440 nm）来检测，除脯氨酸以外的其他氨基酸用VIS1（570 nm）来检测（见图1和图2）。

由图1可以看出，氨基酸分析仪在32 min内能够将混标中的16种氨基酸很好地分离。由图2可以看出，蜂蜜待测液通过盐酸水解后几乎没有杂质干扰，各种氨基酸的分离效果良好，各氨基酸的峰形良好，且出峰时间与峰形和标准品比较一致。这说明蜂蜜中各种氨基酸含量可以通过本法较准确地获得。对盐酸水解后的6个蜂蜜样品通过利用氨基酸分析仪进行测定，并对检测结果进行分析，蜂蜜的氨基酸总含量在0.106 7～0.194 9 g/100 g，其中，苯丙氨酸的含量最高，为0.010 6～0.048 g/100 g;组氨酸的含量最低，为0.001 3～0.002 9 g/100 g;其他氨基酸的含量范围为0.001 8～0.029 5 g/100 g，见表4。

3 结论

6种蜂蜜的总氨基酸含量在0.106 7～0.194 9 g/100 g，可以通过本方法检测蜂蜜中氨基酸的含量，并可用于初步判断蜂蜜中是否添加非蛋白成分。由于正常蜂蜜中的氨基酸组成相对稳定，蜂蜜中各氨基酸的比值可以作为判断蜂蜜是否掺假的依据。

参考文献：

[1]陳盛禄.中国蜜蜂学[M].北京：中国农业出版社，2002.

[2]李钦龙.不同蜂蜜中蛋白质的差异性研究[D].福州：福建农林大学，2012.

[3]Won S，Lee D，Ko S H，et al.Honey major protein characterization and its application to adulteration detection[J].Food Research International，2008，41（10）：952-956.

[4]林洁茹，周华，赖小平.蜂蜜研究概述[J].中药材，2006，29（1）：85-90.

[5]朱春红，雍韦，徐厉，等.蜂蜜真假鉴定技术研究[J].中国食品卫生杂志，2007，19（3）：206-208.

[6]冯志强，许银叶，黄永连，等.氨基酸自动分析仪测定胶原蛋白保健品中羟脯氨酸的含量[J].食品工业，2014，35（5）：248-250.

[7]林丹，庄俊钰，黄永连，等.白蜂蜜的氨基酸指纹图谱构建及识别研究[J].食品工业，2014，36（7）：269-272.