彭 荣,龚 倩
复旦大学附属中山医院青浦分院检验科,上海 201700
结核分枝杆菌感染引起的结核病是全球造成死亡病例最多的单一传染病[1]。肺结核的诊断一直依赖于痰标本检测,但40%的疑似肺结核患者无痰或少痰[2],这类患者往往容易被漏诊。近年来,纤维支气管镜被广泛应用,其提供的细菌学和病理学诊断依据逐渐受到重视。多种检查方法,如活检、刷检、支气管肺泡灌洗液(BALF)涂片及培养等,联合应用可以提高结核分枝杆菌的检出率。结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测体系(GeneXpert MTB/RIF)是一套整合了核酸准备、扩增、实时检测,用于结核分枝杆菌和利福平耐药检测的全自动化检测技术,是WHO推荐的检测结核分枝杆菌的新方法[3];而对于很多无痰或少痰的患者,GeneXpert MTB/RIF无法对其痰液标本进行检测,故本研究将此检测技术用于无痰和少痰患者BALF标本的检测,比较该技术与传统BALF涂片法和培养法对肺结核的诊断价值,现报道如下。
1.1一般资料 选取该院2017年10月至2018年10月无痰或少痰肺结核患者100例作为观察组,无痰或少痰其他肺部疾病患者50例作为对照组。观察组:男67例,女33例;年龄17~51岁,平均(28.4±15.7)岁。对照组:男24例,女26例;年龄19~56岁,平均(30.4±12.7)岁;肺部肿瘤23例,支气管扩张27例;排除可能合并肺结核的患者。肺结核诊断参照《肺结核诊断标准》[4]。对照组肺部肿瘤、支气管扩张等疾病的诊断参照文献[5]。另外,无痰或少痰是指送检的痰液标本性状为水样或者黏液样并少于1 mL。
1.2仪器与试剂 纤维支气管镜为奥林巴斯BFP60型;GeneXpert MTB/RIF和配套试剂盒均为美国赛沛公司产品;BALF涂片法使用的染色液为珠海贝索公司产品;BALF培养法使用罗氏培养基,购自上海申启生物科技公司。
1.3方法
1.3.1BALF标本的获取 使用纤维支气管镜,选取纳入研究者病变累及的肺段作为灌洗部位;使用一次性灌洗液回收装置,将50 mL无菌生理盐水分2次经过纤维支气管镜注入病变累及的叶段支气管,然后用负压吸引缓慢回收,混匀后送检。每份BALF标本约5 mL,平均分成2份,1份用于涂片法和培养法检测;1份于-20 ℃冻存,用于GeneXpert MTB/RIF检测。
1.3.2涂片法和培养法 涂片法:待测BALF以3 000×g离心15 min,取沉淀涂片;沉淀为浓厚的痰样,涂片才容易固定;涂片自然干燥,紫外照射2 h,用抗酸染色液手工染色。培养法:在涂片完成之后的沉淀中加入等体积的4%氢氧化钠,消化15 min后,取两滴加入到罗氏培养基斜面。所有操作及后续涂片镜检和培养结果的判读都严格按照《结核病实验室检验规程》[6]进行。
1.3.3GeneXpert MTB/RIF检测 将之前冻存的BALF平衡至室温,取1.5 mL BALF加入50 mL尖底离心管中,加入700 mL试剂盒自带的标本处理液,静置15 min,期间漩涡振荡1~2次。将检测盒打开,吸取2 mL处理后的样品并缓慢加入到检测盒中,上机检测。机器设有A、B、C、D、E 5条相互重叠的分子探针,能够与利福平rpoB基因的 81 bp 核心区结合并完全覆盖。另外,此反应体系中还包含1个球芽孢杆菌特异探针作为内对照,当内对照探针的循环阈值(Ct)值≤38 时为阳性,反之则为无效。结核分枝杆菌阳性的诊断标准为 5个探针中至少2个探针Ct 值≤38,并可进一步按照Ct值对样本中的结核分枝杆菌进行半定量分析,Ct值<16为高荷菌量,16~22为中等荷菌量,>22~28为低荷菌量,>28为极低荷菌量。检测利福平是否耐药是基于结核分枝杆菌特异分子探针最早期的Ct值和晚期的Ct值之差,即ΔCt值,系统设置的判断标准为当ΔCt>3.5时判断为对利福平耐药,当ΔCt≤3.5时判断为对利福平敏感[3]。约2 h后,反应结束,读取检测结果并打印存档。
1.4统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计处理。灵敏度和特异度的计算以临床诊断为参考标准。涂片法、培养法和GeneXpert MTB/RIF检测用于肺结核诊断的灵敏度、特异度比较采用χ2检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
2.13种方法的检测结果 对照组中,2例支气管扩张患者培养法检测阳性,后来送相关机构鉴定,1例为非结核分枝杆菌,另1例为弱抗酸的诺卡菌属,并非分枝杆菌;但当时培养基上的形态及菌落涂片镜下观察显示为抗酸杆菌,被误认为是分枝杆菌。观察组中,未见利福平耐药的患者。见表1。
表1 两组患者结核涂片法、培养法、GeneXpert MTB/RIF检测结果[n(%)]
2.2灵敏度和特异度的比较 3组间灵敏度比较,差异有统计学意义(P=0.013);然后进行两两比较,GeneXpert MTB/RIF与涂片法的灵敏度差异有统计学意义(P<0.05),其余两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。3组间特异度比较,差异无统计学意义(P=0.132)。见表2。
表2 涂片法、培养法、GeneXpert MTB/RIF诊断效能的比较(%)
结核病的快速诊断是其防控的关键。GeneXpert MTB/RIF作为快速诊断结核的利器,自问世以来,在肺结核和肺外结核的诊断应用中进行过诸多评估。国外有学者做了大样本的肺结核GeneXpert MTB/RIF的应用评估,得出涂片法、GeneXpert MTB/RIF、培养法在肺结核诊断中的灵敏度分别为18.90%、23.85%和20.35%[7]。国内学者也得出GeneXpert MTB/RIF、涂片法和培养法检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异度分别为 37%和 99%、17%和 98%、37% 和 95%[8]。GeneXpert MTB/RIF用于痰标本检测的优势显而易见。对于BALF,国内有学者做过BALF的GeneXpert MTB/RIF检测研究,特别是针对菌阴肺结核,得到的灵敏度数据不一致,但特异度较一致[9-13]。本研究以临床诊断为标准,涂片法、培养法、GeneXpert MTB/RIF检测对于肺结核诊断的灵敏度和特异度分别为13%和100%、21%和96%、30%和100%,与劳海黎等[9]的结果较为一致。与其他几位学者的结果[10-13]比较,本研究的灵敏度略低,韩丹等[10]和李妍等[11]报道的灵敏度高达60%,这可能是因为本研究选择的都是无痰和少痰的患者,肺部炎症轻,渗出少,结核分枝杆菌载量少,而在特异度方面较为一致。
GeneXpert MTB/RIF检测与涂片法的灵敏度差异有统计学意义;GeneXpert MTB/RIF与培养法的灵敏度差异无统计学意义,这与张志学等[13]的报道相符。另外,3种方法在特异度方面无明显差异,甚至培养法在对照组也检出2例阳性,后经鉴定,检出的菌株并非分枝杆菌,培养法的特异度因此降为96%。另外,从检测时效性方面考虑,GeneXpert MTB/RIF检测只需耗时2 h就有结果,培养法却需要3~4周才会有阳性结果,GeneXpert MTB/RIF检测有很大的优势。更重要的是,GeneXpert MTB/RIF检测以rpoB基因为靶基因,能正确鉴定出 97.6%的利福平耐药菌株[14],与比例法测得的利福平耐药结果比较,差异无统计学意义[15]。
综上所述,用BALF做GeneXpert MTB/RIF检测,特异度高,灵敏度明显高于传统的BALF涂片法,用时短,而且能快速判断是否对利福平耐药,对于无痰和少痰肺结核患者的快速诊断有较大的价值。