新型冠状病毒特异性抗体检测对COVID-19的诊断价值 *

郑晓丹，胡玉海，田佩孚，姚成芳

1.湖北省武汉市汉口医院检验科，湖北武汉 430010；2.山东省医学科学院基础医学研究所，山东济南 250062

在新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染早期，由于体内病毒载量较低、标本采样的手法差异以及病毒核酸检测过程中的操作差异等原因，病毒核酸检测的阳性率并不高，湖北省曾将核酸检测阴性但临床症状和CT表现符合《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》的患者，纳入“临床诊断”分类[1]。2020年3月4日国家卫生健康委员会颁布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》将SARS-CoV-2特异性抗体血清学检测纳入诊断标准[2]。抗体是机体感染病毒后，由浆细胞所产生并可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。通常在感染早期出现免疫球蛋白M(IgM)，在感染中晚期出现免疫球蛋白G(IgG)，并可在血液循环中存在较长时间[3-4]。因此，检测病毒特异抗体可以用来辅助诊断患者是否近期或既往感染过SARS-CoV-2，有助于核酸检测阴性但临床上疑似者的诊断。本研究对70例新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者的血清SARS-CoV-2 IgM、IgG采用胶体金免疫层析技术进行了检测，旨在探讨血清SARS-CoV-2特异性抗体检测对COVID-19的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2020年1月26日至2020年3月6日在武汉市汉口医院进行隔离治疗的COVID-19患者70例纳入研究，包括SARS-CoV-2核酸检测阳性患者42例和核酸检测阴性但临床症状和CT表现符合《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(第五版)》的患者28例。男39例、女31例，男女比例为1.26∶1，年龄28～88岁、中位年龄60岁。COVID-19的诊断参照《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第4版)》和《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第5版)》中的标准。

1.2仪器与试剂 病毒RNA提取试剂盒由辉瑞制药有限公司提供，实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)试剂、引物及荧光探针由湖南圣湘生物科技股份有限公司提供。采用美国赛默飞世尔公司ABI 7500 型qPCR仪进行扩增。根据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第三版)》[5]推荐的引物探针，进行病毒基因开放读码框(ORF)1ab及核壳蛋白(N)的检测。血清SARS-CoV-2 IgM、IgG检测试剂盒由珠海丽珠试剂股份有限公司提供。

1.3方法 所有纳入研究者均在入院后治疗前采集外周空腹静脉血5 mL，装入无抗凝剂分离胶管中，静置待自然凝固后3 500 r/min离心5 min，分离血清。分别取10 μL血清标本加入到SARS-CoV-2 IgM检测卡的加样孔中，垂直滴加100 μL标本稀释液，加样后1～15 min内观察结果，根据试剂盒说明判定结果。SARS-CoV-2 IgG检测方法同IgM。采集所有患者的鼻咽拭子标本，采用核酸提取试剂盒从200 μL 的鼻咽拭子标本中获得50 μL 总RNA 溶液，提取的RNA保存于-20 ℃备用。按照试剂说明书配制反应体系溶液和设置反应条件，放置荧光定量PCR仪进行检测，按照试剂说明书判定结果。

1.4统计学处理 采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析，计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1患者年龄、性别与重症率的关系 本研究共纳入70例COVID-19患者。男性患者39例，其中≥50岁的患者31例(79.49%)，≥60岁的患者21例(53.85%)，≥70岁的患者12例(30.77%)；女性患者31例，其中≥50岁患者24例(77.42%)，≥60岁患者17例(54.84%)，≥70岁患者8例(25.81%)。重症患者38例，其中≥50岁患者36例(94.74%)，≥60岁患者30例(78.95%)，≥70岁患者15例(39.47%)。≥60岁的患者重症率高于<60岁的患者(P<0.05)；男女性患者重症率比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同年龄段、不同性别患者重症率的比较

2.2核酸及抗体检测结果与重症率的关系 核酸检测阳性患者重症率明显高于核酸检测阴性患者(P<0.05)；IgM阳性和阴性患者、IgG阳性和阴性患者重症率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 不同核酸、抗体检测结果的重症率比较

2.3血清SARS-CoV-2 IgM和IgG检测结果的评价 SARS-CoV-2 IgG检测的灵敏度高于SARS-CoV-2 IgM(χ2=9.258，P=0.002)；SARS-CoV-2 IgM、IgG联合检测的灵敏度高于SARS-CoV-2 IgM(χ2=15.04，P<0.05)；SARS-CoV-2 IgM、IgG联合检测的灵敏度与SARS-CoV-2 IgG比较，差异无统计学意义(χ2=1.069，P=0.301)，见表3。SARS-CoV-2 IgM和SARS-CoV-2 IgG检测对COVID-19都具有较高的检出率，二者联合检测效果更佳。

表3 SARS-CoV-2 IgM、IgG的检测灵敏度

2.4血清SARS-CoV-2抗体检测对核酸检测阴性病例的价值 在70例COVID-19患者中，核酸检测阳性有42例，其中男25例、女17例，阳性率为60.00%。核酸检测阴性患者28例，其中男14例、女14例。在28例核酸检测阴性的COVID-19患者中，SARS-CoV-2 IgM单项阳性17例，SARS-CoV-2 IgG单项阳性26例，SARS-CoV-2 IgM、IgG联合检测阳性26例，表明SARS-CoV-2抗体检测有助于核酸检测阴性患者的诊断。

3 讨 论

及时、快速诊断是疫情防控工作的重要环节[6]。SARS-CoV-2核酸检测被认为是COVID-19确诊的“金标准”，然而在实际工作中，病毒核酸检测的阳性率并不高，尽管有的患者已表现出较重的临床症状，且CT也显示肺部有COVID-19的特征性影像学表现，但核酸检测结果仍为阴性。核酸检测结果的影响因素有采集标本的规范化程度、实验室检测手段、试剂盒质量、病毒核酸载量等[7-8]。就标本取材这一环节而言，在呼吸道标本中，肺泡灌洗液检测的灵敏度高于痰液，痰液又高于咽部拭子[9]。但是肺泡灌洗液的检测仅适用于极少数患者，多数轻症患者并没有痰液，因此对大部分患者的检测，一般是采集咽拭子。本研究的70例COVID-19患者中，病毒核酸检测阳性患者仅42例(60.00%)。病毒核酸检测的低阳性率给患者确诊带来困难，轻症患者得不到及时确诊、收治入院就极有可能发展为重症。为此，在《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(第五版)》中，CT影像学的特征被纳入诊断标准，这让一些核酸检测呈假阴性但影像学有典型表现的患者能够及早得到救治，这一方案在特殊时期对于疫情严重的湖北地区控制疫情曾起到重要作用。

在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》中，SARS-CoV-2特异性抗体血清学检测被纳入诊断标准。COVID-19患者多数为中老年人，在本研究中，老年患者占半数以上(54.29%)，该类患者免疫器官功能衰退，免疫功能下降，更易发展为重症，但老年人往往具有较高比例的记忆性淋巴细胞，遍布各个器官或黏膜组织，在病毒侵袭时，即可迅速活化，发生一系列免疫反应，产生抗体，可为诊断提供准确的信息[10-11]。本研究中，核酸阳性患者重症率显著高于核酸阴性患者，这与核酸阳性患者体内有较高的病毒载量有关。而抗体阳性患者重症率与抗体阴性患者比较，差异无统计学意义(P>0.05)，还需更多的数据积累来进一步探讨。抗体是机体体液免疫应答的产物，由于感染SARS-CoV-2后可呈现较长的潜伏期，机体在初次接受病毒抗原刺激后，有足够的时间刺激B细胞增殖并分化为浆细胞，产生病毒特异性抗体。在感染的早期，主要产生IgM类抗体，随后其水平会逐渐降低直至消失，在感染的中后期，由于B细胞在生发中心发生抗体类别转换而产生IgG类抗体，其水平在体内会有一个指数式增长的过程，之后水平会趋于稳定，并在血液循环中存在较长时间[12-13]。因此，检测SARS-CoV-2的特异性抗体可用来判断患者是否近期感染或者既往感染过SARS-CoV-2。

本研究中，SARS-CoV-2 IgM和IgG检测均具有较高的灵敏度，可满足临床的诊断和筛查需要，但SARS-CoV-2 IgM的灵敏度低于SARS-CoV-2 IgG，这可能是由于COVID-19的潜伏期较长，且部分患者往往在出现症状后一段时间才会就医，此时可能处于感染中后期，其外周血SARS-CoV-2 IgM水平处于降低或消失阶段，但SARS-CoV-2 IgM和IgG二者联合检测有助于提高检出率，且可根据检测结果对患者所处感染阶段进行大致推断。此外，在28例核酸检测阴性的COVID-19患者中，有26例检测出SARS-CoV-2 IgM或IgG阳性，表明SARS-CoV-2抗体检测可与核酸检测结果互补。

笔者还注意到有1例患者病毒核酸检测为阳性，而SARS-CoV-2 IgM和IgG检测均为阴性。该患者是在出现咳嗽、乏力等症状后第3天采集鼻咽拭子和静脉血分别做病毒核酸和抗体检测，按照目前SARS-CoV-2感染潜伏期多为3～7 d计算，该患者感染约为6～10 d，推测此时病毒虽已在体内进行复制，但病程较短，病毒诱发的机体抗病毒体液免疫反应尚处于早期，产生的抗体滴度处于较低水平，尚不能在外周血中检测到。这也提示，在病毒感染初期，SARS-CoV-2抗体检测具有一定局限性。

综上所述，血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体检测灵敏度高，可有效降低核酸漏检的风险，且血清抗体检测操作简便、快速，可与病毒核酸检测形成互补。由于本研究收集的数据有限，仅为一个初步的探讨，要获得更确定的结论还需进一步进行研究。