低共熔溶剂和次氯酸钠组合预处理秸秆及在丁醇发酵中的应用

李浩，邢婉茹，许国超，倪晔

（江南大学生物工程学院，江苏无锡214122）

木质纤维素生物质在农业和林业中广泛分布[1]。由于其可再生性、丰富性，易于获得和廉价性，是微生物发酵生产生物燃料（如乙醇、丁醇、甲烷和氢气）、大宗化学品（如柠檬酸和乳酸）和高附加值精细化学品的原料[2]。水稻秸秆（简称稻秆）是收割稻米后残留在田间的植物残渣，每收获1kg 稻米可生产0.41～3.96kg 稻秆[3]。因为稻米是世界上第三重要的谷类作物，所以稻秆是世界上最丰富的木质纤维素生物质之一[4]。据统计，我国年产稻秆约1.8×108t[5]。由于稻秆在土壤中降解缓慢，并且带有稻茎病菌和高矿物质含量，所以大部分稻秆被露天焚烧，仅有小部分稻秆被用作饲料[6-7]。然而，这种做法导致了诸如CO2、CO、NOx和SO2等污染物的排放[8-10]，严重危害环境安全和公共卫生[11]。实际上，稻秆中纤维素和半纤维素含量较高，可作为生产生物燃料的重要原料[3]。因此，稻秆的综合利用已经引起越来越多的关注。

尽管稻秆可以作为生产再生能源的原料，但由于纤维素和半纤维素被木质素层紧密地包裹，因此纤维素和半纤维素的可及性受到严重限制[12]。为了提高生物质中纤维素对纤维素酶的可及性，需要对稻秆进行预处理以去除半纤维素和木质素，从而使纤维素暴露出来。理想的预处理方法应既能有效去除木质素和半纤维素，又具有较高的成本效益和能源效率，以及高度的生物相容性[1,13]。木质纤维素生物质预处理的方法有多种，包括碱、酸、离子液体和有机溶剂等[3,14]。其中，酸性预处理方法的研究较为深入，具有低成本、高效率破坏生物质顽抗性等显著优势[15-16]。但是，酸对木质素去除效果不佳，而木质素含量是影响纤维素酶对秸秆水解效率的主要因素。碱性的次氯酸钠等对秸秆中的木质素（尤其是酸不溶木质素）具有良好的去除效果，如易守连[17]发现用次氯酸钠溶液在75℃下处理玉米芯2h后，玉米芯中木质素去除率达到41.36%。离子液体是有前景的预处理试剂，具有低熔点、低蒸气压、可回收利用和良好的生物相容性等优点[18]。由氢键受体和氢键供体组成的低共熔溶剂（deep eutectic solvent,DES）是具有与传统离子液体相似特性和更低价格的一类新型离子液体[19-20]。事实证明，DES可以有效地预处理各种木质纤维素生物质，例如玉米秸秆、玉米芯和稻秆等[21-23]。在木质纤维素生物质的综合利用中，开发新型DES或改善DES预处理效果对生物质的利用和环境保护具有重大意义。

考虑到酸性试剂对木质纤维素生物质的有效性，基于弱酸的DES 是用于木质纤维素生物质预处理的良好试剂之一。在前期研究中，本文作者课题组合成了基于乙胺盐酸盐（EaCl） 和乳酸（LAC）的新型DES。为改善该酸性DES 在预处理稻秆时木质素去除率不高的问题，本文建立并优化了DES 与碱性氧化剂的组合预处理方式，采用Clostridium saccharobutylicum DSM13864菌株利用稻秆水解液进行丁醇发酵，评估了其在生物丁醇发酵中的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 实验材料

水稻秸秆购买于山东泽生生物科技有限公司，经粉碎后过40目筛子，放置在4℃冰箱中备用。乙胺盐酸盐和乳酸购买于上海泰坦化学有限公司。纤维素酶来自青岛蔚蓝生物股份有限公司。丁醇发酵菌株Clostridium saccharobutylicum DSM13864购买于德国DSMZ微生物菌种保藏中心。

发酵培养基：硫酸铵2g/L，玉米浆干粉10g/L，碳酸钙4g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，无水磷酸氢二钾0.5g/L，葡萄糖60g/L，pH 调至6.5，115℃灭菌20min。

1.2 实验方法

1.2.1 EaCl∶LAC处理水稻秸秆及预处理条件优化

按照文献[22]的方法合成低共熔溶剂EaCl∶LAC。

将50mL EaCl∶LAC 和5g 水稻秸秆加入到250mL 三口圆底烧瓶中，130℃油浴加热，并机械搅拌处理2h。真空过滤收集处理后的水稻秸秆，并用自来水洗涤几次，以除去残留的EaCl∶LAC。处理后的水稻秸秆在60℃烘箱中烘干备用。

采用上述方法对预处理条件进行优化。对于预处理时间的优化，在130℃下分别预处理0.5h、1h、2h 和3h；对于秸秆加载量，仅通过将EaCl∶LAC添加量改为30mL、40mL和60mL来优化。

为了循环利用EaCl∶LAC，通过真空抽滤分离得到EaCl∶LAC，并将其在80℃下进行真空旋转蒸发以除去残留水分，如上操作可回收约90%的EaCl∶LAC，对于下一批次预处理，在此回收基础上再补加10%的新鲜EaCl∶LAC 以保持每批次的体积相同。

1.2.2 EaCl:LAC和NaClO组合处理水稻秸秆

用NaClO对经EaCl∶LAC预处理的稻秆进行组合处理。将50mL 5g/L NaClO 添加到250mL 三口烧瓶中并加热至30℃。然后向上述装置中添加5.0g处理过的稻秆，避光浸泡24h。此步处理过的稻秆同样用自来水洗涤几遍后将其烘干备用。

为了达到更好的处理效果，在30℃下，将EaCl∶LAC 处理过的稻秆分别按照1∶8、1∶10、1∶12 和1∶15 的固体加载量，分别浸泡在0、1g/L、5g/L、10g/L、20g/L 和50g/L 的NaClO 溶液中，浸泡6h、12h、24h、48h 和72h，洗净、烘干之后用于后续酶解反应。

1.2.3 稻秆的纤维素酶酶解

将1g经预处理的稻秆添加到50mL具塞锥形瓶中，并与10mL柠檬酸盐缓冲液（pH4.8，50mmol/L）、100mg/L 氨苄青霉素以及50FPU/g 纤维素酶混合。将上述混合物在50℃和120r/min 下温育24h。按照不同时间间隔从酶解液中取300μL 样品，以12000r/min 离心10min，用HPLC 检测上清液中还原性糖的浓度。其检测条件如下：色谱柱型号为Hi-Plex H（300mm×7.7mm）柱，示差检测器的温度为25℃，进样量为10μL，流动相为蒸馏水，流速为0.6mL/min，柱温为65℃。

1.2.4 稻秆的结构表征及理化性质分析

对预处理前后稻秆中纤维素、半纤维素和木质素等含量变化按之前报道方法[22]进行测定。用扫描电子显微镜（5.0kV，×1200 Hitachi S-4800，日本）观察预处理前后稻秆的表面形态变化。预处理前后稻秆的结晶度变化是通过射线源为铜靶的X射线衍射仪（XRD）在40kV 电压和40mA 电流下进行检测的，其中2θ 角的扫描范围为5°～80°，步长为0.02°。

1.2.5 稻秆水解液的丁醇发酵

将梭菌发酵培养基中的葡萄糖替换为稻秆水解液，其余成分的含量保持不变，向发酵培养基中接种10%（体积分数）已传代活化的C.saccharobutylicum DSM13864，设置3 个平行样，将厌氧发酵小瓶置于干燥器中，抽真空（0.065MPa）后放于37℃培养箱中静置厌氧发酵。发酵液中丙酮、乙醇和丁醇采用气相色谱法测定，方法如下：色谱柱为PEG-2M 毛细管色谱柱，检测器为FID，载气为氮气，进样量1μL，分流比为90∶1，以异丁醇作为内标进行测定。

2 结果与讨论

2.1 EaCl∶LAC处理稻秆及处理条件优化

采用乙胺盐酸盐和乳酸组成的新型低共熔溶剂EaCl∶LAC处理稻秆后，经酶解后产生的总还原糖浓度为29.7g/L，明显高于未经处理稻秆酶解后的糖浓度（9.3g/L）。经EaCl∶LAC 处理后，酶解效率提高约219%。采用氯化胆碱型Foraceline[23]处理稻秆，经酶解48h后总糖浓度为21.5g/L，其处理效果同样低于EaCl∶LAC。因此，EaCl∶LAC表现出了非常好的稻秆预处理效果。

为了得到最优的预处理效果，考察了时间与固液比对稻秆预处理效果的影响。分别将稻秆用EaCl∶LAC 在130℃下处理0.5～3h，处理后的稻秆进一步酶解得到水解液。经分析可知，酶解液中总还原糖浓度从18.03g/L （0.5h） 增加到32.10g/L（2.0h）[见图1(a)]。进一步延长处理时间至3.0h时，总还原糖浓度略降至31.39g/L。这是由于在一定时间范围内，随处理时间增加，木质素与半纤维素被逐渐破坏，从而提高了纤维素的可及性，最终使得总还原糖浓度随时间延长而增加。但处理时间过长将导致稻秆中的纤维素结构的破坏和总还原糖浓度的下降。进一步考察了1∶6、1∶8、1∶10 和1∶12等固液比（稻秆/EaCl∶LAC）对稻秆预处理效果的影响[见图1(b)]。当固液比为1∶12时得到最高总还原糖浓度33.04g/L，略高于固液比为1∶10时的糖浓度（32.1g/L），远高于固液比为1∶6 和1∶8 时的糖浓度[见图1(b)]。虽然提高EaCl∶LAC添加量有利于脱除木质素，但综合考虑糖浓度及经济成本，选择固液比为1∶10 进行后续研究。综上，最终确定EaCl∶LAC 处理稻秆的条件为固液比1∶10，130℃处理2.0h。

图1 EaCl∶LAC预处理水稻秸秆的条件优化

为了进一步提高EaCl∶LAC 的应用潜力，通过过滤分离EaCl∶LAC，再经蒸发去除残留水分后进行新一批次预处理。在上述最佳条件下进行了6轮重复使用，总糖浓度如图1(c)所示。在第二批处理时，总糖浓度减少至30.91g/L，仅比新鲜EaCl∶LAC 处理时低3.7%，证明了EaCl∶LAC 回收利用的可行性。在第6批处理时，总糖浓度降至26.11g/L，比新鲜的EaCl∶LAC 低18.7%，仍能达到新鲜EaCl∶LAC处理效果的80%，故EaCl∶LAC可以被回收和重复使用，大大降低了其使用成本。

2.2 组合预处理水稻秸秆

为了提高木质纤维素生物质的处理效果，组合预处理常被认为是一种有效的方法，即引入另外一种具有协同作用的试剂来促进木质素或半纤维素的脱除。碱性试剂具有易脱除木质素的效果，使用NaOH 和Na2CO3可进一步提高[Bmim]Cl 和DES 的处理效果[23-24]。因此，本研究引入氧化剂H2O2和NaCIO进行稻秆的组合预处理。首先，将新鲜的稻秆在30℃用H2O2（1%，体积分数）和NaClO（5g/L）溶液浸泡，经此处理后稻秆酶解液中总糖浓度分别为9.81g/L和23.07g/L[见图2(a)]。NaClO在对稻秆的预处理中更为有效，不仅可以用作氧化剂，而且还具有碱性。双重作用使NaClO 具有破坏酯键的能力，有利于去除木质素和改善木质纤维素生物质的孔隙率。本实验还探索了EaCl∶LAC 和H2O2或NaClO 预处理顺序对预处理效果的影响。在EaCl∶LAC 和H2O2或NaClO 的处理顺序研究中，EaCl∶LAC/H2O2和H2O2/EaCl∶LAC 处理后的稻秆酶解液中总还原糖浓度分别为33.57g/L 和32.95g/L。与EaCl∶LAC单独处理相比，H2O2组合预处理并没有提高总糖浓度。然而，采用EaCl∶LAC/NaClO处理的稻秆酶解液中总糖浓度显著增加至50.96g/L[图2(a)]。更换处理顺序，NaClO/EaCl∶LAC 预处理稻秆的总糖量为36.21g/L，仅比EaCl∶LAC单独处理时高4.1g/L。结果表明：先用EaCl∶LAC 处理、再用NaClO浸泡的组合预处理方式具有最高的酶解效率，NaClO能够进一步去除稻秆中未被EaCl∶LAC 破坏掉的木质素，使纤维素结构更好地暴露，提高了纤维素在酶解中的可及性。

图2 EaCl∶LAC和NaClO对稻秆预处理的条件优化

对影响EaCl∶LAC/NaClO组合预处理的各种因素进行了优化。首先，采用1～5g/L等不同的NaClO添加量。随着NaClO添加量的增加，酶解液中总糖浓度逐渐增加，当NaClO浓度为5g/L时，可获得最高的总糖浓度62.78g/L[见图2(b)]。在10g/L NaClO下，总糖浓度为60.52g/L，仅比50g/L NaClO 时低2.26g/L。较高的NaClO加载量会增加反应器的腐蚀和预处理成本。因此，10g/L NaClO 的加载量也可满足组合预处理要求，其总还原糖浓度满足丁醇发酵对糖浓度的要求。其次，通过不同时间间隔取样来优化NaClO 浸泡处理的时间。如图2(c)所示，当处理12h 时酶解液中总糖浓度达到60g/L，此后随着时间的延长，总糖浓度并没有增加，因此选择NaClO 处理时间为12h。最后，优化固体（经EaCl∶LAC 预处理的稻秆）与液体（NaClO 溶液）的比例，考察其对处理效果的影响。当固液比为1∶8时，总糖浓度为52.70g/L。进一步增加固液比为1∶10、1∶12 和1∶15 时，总糖浓度分别为59.05g/L、60.46g/L和60.42g/L。因此，选择固液比为1∶12。综上，NaClO 处理的最佳条件是将稻秆（经EaCl∶LAC预处理）用10g/L NaClO在固液比为1∶12的条件下浸泡12h。

2.3 组合处理稻秆的结构表征及理化性质分析

表1总结了EaCl∶LAC和NaClO 预处理前后稻秆组成成分的变化。对于用EaCl∶LAC 和NaClO单独处理的稻秆纤维素质量分数分别从31.5%增至50.9%和39.9%。当用NaClO/EaCl∶LAC和EaCl∶LAC/NaClO 处理稻秆后，其纤维素质量分数进一步增至64.9%和76.1%。这表明经过组合处理，尤其是经过EaCl∶LAC/NaClO 处理后的稻秆中纤维素质量分数显著增加。稻秆经EaCl∶LAC/NaClO处理后，半纤维素去除率高达94.9%，远高于经EaCl∶LAC 和NaClO 单独处理稻秆的66.0%和51.9%。稻秆经EaCl∶LAC/NaClO 处理后，酸溶木质素质量分数从2.5%降低到0.5%，该效果略优于EaCl∶LAC 和NaClO 单独处理时的效果（降低至0.9%）；EaCl∶LAC对酸不溶木质素没有明显的去除效果，NaClO 对酸不溶木质素有一定的处理效果（质量分数从27.5%降低至21.4%），而经两者组合处理后，酸不溶木质素质量分数从27.5%降低至15.3%，这极大地弥补了EaCl∶LAC 对酸不溶木质素去除效果不佳的劣势。经EaCl∶LAC/NaClO 预处理后，稻秆中总木质素质量分数从未处理的30%降至15.8%，脱除了约80.2%的木质素，木质素去除率远高于EaCl∶LAC 单独处理时的43.1%。从此结果可知，EaCl∶LAC/NaClO 组合预处理方式可弥补两者单独处理时半纤维素与木质素去除效果不佳的情况，从而使得稻秆中纤维素结构更易与纤维素酶作用。用EaCl∶LAC/NaClO 处理的稻秆的CrI 为60.2%，该数值为所有测试样品中最高值（见表1）。结晶度（CrI）值增加可能是由于去除了半纤维素和木质素等无定形组分，这些成分的去除有利于提高纤维素含量[25]。预处理前后稻秆化学成分分析表明， 用EaCl∶LAC 和NaClO 组合预处理可以通过减少半纤维素和木质素，显著增加酶水解中纤维素的可及性，这也与用EaCl∶LAC/NaClO 预处理的稻秆酶解液中较高的总糖含量一致。

表1 不同方法处理后的水稻秸秆各组分质量分数

通过SEM 分析探讨了稻秆预处理前后的物理性质变化。与未处理的稻秆相比，用EaCl∶LAC处理的稻秆表面变得粗糙和皱缩。这是由于部分半纤维素和木质素的去除破坏了稻秆表面的立体结构，并暴露出内部结构。经NaClO处理的稻秆变得疏松，具有更大的比表面积。采用EaCl∶LAC/NaClO 组合处理的稻秆中，表面变得更加疏松多孔，使纤维素更多暴露出来[26]。组合处理前后稻秆表面的差异同样揭示了半纤维素和木质素的高效去除，这有利于增强纤维素的可及性。

图3 水稻秸秆的SEM图

2.4 利用稻秆水解液进行丁醇发酵

探索了EaCl∶LAC/NaClO处理后稻秆的高糖酶解液在生物丁醇生产中的应用潜力。以Clostridium saccharobutylicum DSM13864 为发酵菌种，发酵培养基见2.1 节，其中实验组以总糖浓度为60.46g/L的酶解液为碳源，对照组以60.46g/L的葡萄糖为碳源。如图4所示，发酵过程中监测了溶剂、残糖和乳酸随发酵时间的变化。 以残糖表示C. saccharobutylicum DSM13864 菌体在发酵初期的生长情况。在对照组中，发酵初期菌体快速生长。从12h 开始，菌体开始快速生产丁醇、丙酮和乙醇，直至48h 为止。发酵72h 后，发酵液中残留8.64g/L葡萄糖，共消耗46.98g/L葡萄糖。发酵过程中产生约10.23g/L 丁醇，产率为0.22g/gglucose，时空产率为0.14g/(L·h)，总溶剂浓度达到16.87g/L，产率为0.36g/gglucose，时空产率为0.23g/(L·h)。对于实验组，菌体生长在最初12h内存在一定的抑制情况。在发酵初始阶段，对照组中监测到含有1.92g/L乳酸，并在12h内被逐渐消耗；然而在实验组中乳酸含量为3.69g/L，这可能是菌体生长存在延滞的原因。不过，在发酵培养12h时，实验组中乳酸也被逐渐消耗。从12h开始，实验组中菌体开始快速生长，并在24h 开始大量产生丁醇、丙酮和乙醇。发酵72h 后共消耗了约46.73g/L 总糖，发酵液中丁醇浓度为10.16g/L，产率为0.22g/gtotalsugar，时空产率为0.14g/(L·h)。同时，发酵过程中产生了16.09g/L总溶剂，产率为0.34g/gtotalsugar，时空产率为0.22 g/(L·h)。丁醇产量高于本文作者课题组前期用[Bmim][Cl]处理的玉米秸秆水解液发酵水平（7.4g/L）[24]；同时，总溶剂产量优于Cai 等[27]经NaOH 处理后玉米芯水解液发酵效果（12.2g/L）。综上，尽管残留的乳酸对C. saccharobutylicum DSM13864 的生长具有一定的抑制作用，但乳酸可被梭菌利用并解除该抑制作用，利用稻秆酶解液进行发酵产丁醇的浓度和产率与葡萄糖培养基中相似。因此本实验开发的EaCl∶LAC/NaClO处理方式，无需外源添加碳源和脱毒处理，可以直接应用于丁醇发酵。本研究通过组合酸性DES EaCl∶LAC和碱性NaClO处理稻秆的方式，极大地提高了稻秆中木质素的去除率；在充分发挥酸碱性在预处理中佛如优势的同时，弥补了实际应用中强酸或强碱对于处理设备强腐蚀性的缺点；EaCl∶LAC的循环利用极大地降低了预处理试剂的成本。本研究获得的稻秆酶解液不需脱毒和添加外源碳源即可用于梭菌发酵并获得了较高的丁醇浓度。在实际应用中，可通过选育具有更高丁醇耐受性的菌株以实现更高的丁醇发酵浓度。

图4 C.sacchrobutylicum DSM13864丁醇发酵

3 结论

本实验开发了一种新的EaCl∶LAC/NaClO组合预处理方式用于水稻秸秆的预处理。经该方式处理后，稻秆的半纤维素和木质素去除率分别高达94.9%和80.2%。根据物理表征可知经处理后的稻秆表面变得粗糙皱缩和疏松多孔，稻秆内部的纤维素更好地暴露出来，处理后稻秆经酶解后总糖浓度可高达60.46g/L，该处理方式极大地增加了稻秆中纤维素在酶解中的可及性。稻秆酶解液可作为Clostridium saccharobutylicum DSM13864发酵生产丁醇的碳源，最终丁醇浓度为10.16g/L，产率0.22g/gtotalsugar，时空产率0.14 g/(L·h)，与葡萄糖为碳源的培养基水平相当。本实验为木质纤维素生物质的综合利用提供了一种高效的预处理方式，所获得的水解液总糖浓度较高，且无需脱毒处理可直接用于丁醇发酵。