一起猪链球菌和传染性胸膜肺炎放线杆菌混合感染的诊断报告

刘泽文 袁芳艳 刘威 高婷 周丹娜 杨克礼 郭锐 梁婉 田永祥

摘要：通过对湖北武汉某猪场一起急性死亡猪进行临床诊断和病原分离鉴定，确定是由猪链球菌和传染性胸膜肺炎放线杆菌混合感染引起，分离菌株呈典型革兰氏阳性链状球菌和革兰氏阴性小杆菌，生化鉴定符合猪链球菌和传染性胸膜肺炎放线杆菌的生化特点，分离的猪链球菌和传染性胸膜肺炎放线杆菌对头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟敏感，这几种药物对发病猪有很好的治疗效果。

关键词：猪;链球菌;传染性胸膜肺炎放线杆菌;诊断

中图分类号：S858.28        文献标识码：A        文章编号：1007-273X（2020）11-0005-02

猪链球菌和猪传染性胸膜肺炎放线杆菌是严重危害养猪业的两种细菌病，常造成生猪的急性死亡，给养猪场（户）造成严重的经济损失。湖北武汉某猪场发生一起育肥猪急性死亡病例，发病猪体重40 kg左右，突然死亡，鼻、口有血性泡沫样分泌物流出，后肢关节肿胀。病理解剖可见病猪胸腔有大量渗出物，肺和胸壁出现粘连现象，关节腔有化脓性渗出物。经临床诊断、病理解剖、病原分离鉴定，确定为猪链球菌（SS）和传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）混合感染引起。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  培养基  胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）和胰蛋白胨大豆肉汤（TSB），按产品使用说明方法配制灭菌后加入5%的小牛血清。

1.1.2  药敏纸片  头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、磺胺异恶唑等药敏纸片为杭州滨和微生物试剂有限公司生产，氟苯尼考药敏纸片为Oxoid limited公司生产，按药敏纸片生产公司提供的标准判断结果。

1.2  方法

1.2.1  病料接种及病原分离  分别采集发病猪的胸腔积液和关节脓性分泌物接种5%小牛血清的TSA平板，37 ℃培养24 h，挑选带蓝光的单个菌落再接种5%小牛血清的TSA平板，37 ℃培养24 h后，挑选单个菌落进行革兰氏染色并观察细菌形态。

1.2.2  分离菌株的PCR鉴定  分别按文献[1，2]设计猪传染性胸膜肺炎放线杆菌引物（APP U1-1 ATACGGTTAATGGCGGTAATGG，APP U1-2 ACCTGAGTGCTCACCAACG，扩增大小为345 bp）和猪链球菌引物（gdh-1 AAGTTCCTCGGTTTTGAGCA，gdh-2GCAG CGTATTCTGTCAAACG，扩增大小为566 bp），并进行PCR鉴定，电泳并观察结果

1.2.3  分离菌株生化鉴定  将PCR扩增呈阳性菌株接种改良TSB培养基，37 ℃振摇培养20～24 h，分别接种糖发酵和其他生化试验培养基小管，每管0.2 mL，37 ℃培养，观察结果。

1.2.4  分离菌株的药敏试验  无菌挑取链球菌菌落， 反复均匀地涂布于5%小牛血清TSA平板上，然后将上述药敏纸片等距离（≥2 cm）压放在培养基表面。置37 ℃培养18～24 h取出，观察抑菌圈的有无或直径大小，按药敏纸片生产公司提供的标准判断结果。

2  结果与分析

2.1  细菌形态观察

分离菌株在含5%小牛血清的TSA平板上形成圆形、光滑湿润、无色透明的菌落。挑选单个菌落进行革兰氏染色，可见革兰氏阴性的小杆菌和革兰氏阳性的呈链状的球菌（图1、图2）。

2.2  分离菌株的PCR鉴定结果

用猪传染性胸膜肺炎放线杆菌引物和猪链球菌引物进行PCR鉴定，结果均扩增出条带，且与设计大小相符（图3、图4）。

2.3 分离菌株生化鉴定结果

猪链球菌引物PCR鉴定阳性菌株的乳糖、棉子糖、菊糖和七叶苷为阳性反应;甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、甘油、山梨糖和V.P试验等为阴性反应，与猪链球菌生化特性一致。猪传染性胸膜肺炎放线杆菌引物PCR鉴定阳性菌株的葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、尿素等为阳性反应;M.R-V.P、鼠李糖、山梨醇、靛基质试验等为阴性反应，与传染性胸膜肺炎放线杆菌的生化特性一致。

2.4  分离菌株的药敏试验结果

将分离纯化的菌株按常规方法进行药敏试验，结果表明，分离的猪链球菌对头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、阿莫西林、氨苄西林、环丙沙星高度敏感，对林可霉素、依诺沙星、洛美沙星、四环素、阿米卡星、庆大霉素和磺胺异恶唑耐药;传染性胸膜肺炎放線杆菌对头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、阿米卡星和庆大霉素敏感，对氨苄西林、林可霉素、环丙沙星、依诺沙星、卡那霉素、四环素和磺胺异恶唑耐药（表1）。

3  结果与讨论

（1）武汉市某猪场发生生猪突然死亡情况，通过对发病猪场情况进行调查，了解发病猪的临床特点，进行病理解剖、PCR扩增及生化特性鉴定，综合诊断是由猪传染性胸膜肺炎放线杆菌和猪链球菌混合感染引起的急性死亡。药敏试验证实，分离的猪链球菌和传染性胸膜肺炎放线杆菌对头孢呋辛、头孢曲松和头孢噻肟等高度敏感，这些药物可用于发病猪的紧急治疗。

（2）猪链球菌病是一种人兽共患传染病[3]，是由猪链球菌感染引起，该菌不但能引起猪的急性败血症、 脑膜炎、关节炎甚至死亡，同时也可导致养猪从业人员感染和死亡。该病一年四季均可发生，呈多点散发和突然暴发，也可呈地方性流行。在规模化猪场，猪链球菌病已成为一种常见病和多发病，经常成为一些病毒性疾病的继发病或与一些细菌性疾病混合感染。猪传染性胸膜肺炎的主要病原菌是胸膜肺炎放线杆菌，该病以飞沫和接触性传播为主， 主要临床特征有急性出血性肺炎和亚急性慢性坏死性肺炎[4]。 随着集约化养猪业的发展，国家及地区间引种频繁，该病发病率及死亡率大大高于以前。我国自1987年首次发现该病，现该病已经成为育肥猪和种猪死亡的主要原因之一，血清型也越来越复杂，给养猪业造成了巨大的经济损失。

（3）针对猪链球菌病和猪传染性胸膜肺炎的防控可采用疫苗免疫预防和药物治疗[5][6]。猪链球菌多价灭活疫苗，猪群免疫后间隔15～20 d进行第2次免疫后可以产生较好的效果，免疫期可达半年。猪传染性胸膜肺炎可采用猪传染性胸膜肺炎多价灭活疫苗进行免疫，可起到一定的保护效果，但是因APP血清型众多及地方流行型有别，不同血清型之间交叉保护效果有限，导致免疫效果不理想。对发病猪场可以采用抗生素进行紧急治疗，但是由于猪链球菌和传染性胸膜肺炎放线杆菌易产生较强的耐药性，而且因为不同猪场用药情况差异，其耐药性也存在差异，因此在使用抗生素治疗之前要做药敏试验，筛选对这两种细菌敏感的药物进行治疗，可以取得良好的治疗效果。

参考文献：

[1] 陈  凡.胸膜肺炎放线杆菌血清学分型及基因分型的研究[D].武汉：华中农业大学，2004.

[2] 王松华.猪源链球菌的分离鉴定及其生物学特性研究[D].河南洛阳：河南科技大学，2017.

[3] 罗满林.动物传染病学[M].北京：中国林业出版社，2019.

[4] 朱秀高，李艳青.猪胸膜肺炎放线杆菌感染和血清型分布[J].动物医学进展，2017，38（10）：111-113.

[5] 赵  谦.猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病二联亚单位疫苗的研制[D].北京：中国农业科学院，2019.

[6] 张  飞，曹三杰，文心田等，猪传染性胸膜肺炎疫苗的研究进展[J].中国兽医学报，2015，35（11）：1880-1886.