麻杏解毒合剂治疗新冠肺炎分子机制的网络药理学研究∗

易国祥 付 玉 李延萍 吴 斌 王守富

（重庆市中医院，重庆 400021）

新型冠状病毒肺炎（新冠肺炎）临床以发热、乏力、干咳为主要临床症状，有特征性影像学改变，部分患者发生严重急性呼吸道感染、呼吸衰竭等并发症[1]。中医药治疗新冠肺炎在疫情防控中发挥了重大作用。重庆市中医院根据新冠肺炎的病因病机，总结临床诊治经验，拟定了麻杏解毒合剂，全方由麻黄、杏仁、石膏、浙贝母、蝉蜕、僵蚕、桔梗等药物组成，具有辛凉宣肺平喘、解毒清肺化浊的功效，治疗新冠肺炎早期邪热壅肺，证见发热、咳嗽、痰少、气喘、胸闷等。麻杏解毒合剂在重庆市抗击新冠肺炎疫情中取得了良好的疗效，现已获批院内制剂。本文拟通过网络药理学方法分析该复方的分子机理，为后续的机制研究提供参考。

1 研究方法

1.1 麻杏解毒合剂活性成分信息收集 在TCMSP[2]数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索麻杏解毒合剂11味中药的活性成分，设置筛选阈值：口服利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18。

1.2 活性成分靶点预测 提取麻杏解毒合剂11味中药的活性成分的分子ID，通过分子ID在TCMSP数据库检索对应的药物靶点信息。

1.3 疾病靶点的预测 GeneCards数据库[3]（http：//www.genecards.org/）可以提供已知或正在探索的基因信息。以“Viral pneumonia”为关键词进行捜索，收集与病毒性肺炎相关的基因靶点。

1.4 交集靶点的获取 结合GeneCards数据库建立的疾病靶点，应用 Venny 2.1[4]（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）获取麻杏解毒合剂活性成分靶点与疾病靶点的交集，作为麻杏解毒合剂治疗病毒性肺炎的靶点分析。

1.5 网络构建 将获得的交集靶基因导入String10[5]（https：//string-db.org/），构建蛋白质-蛋白质互作（PPI）网络，再将文本数据导入Cytoscape[6]中构建麻杏解毒合剂的可视化靶点PPI网络，在网络中筛选出起调控作用的关键蛋白。

1.6 网络分析 使用David[7]在线软件（https：//david.ncifcrf.gov/）对交集靶点基因的GO生物学过程（GOBP）和KEGG通路（KEGG Pathway）进行富集分析，并以P=0.05作为显著功能与通路的临界值。

2 结 果

2.1 活性成分的筛选与靶点预测结果 根据TCMSP平台中OB和DL的界定值筛选，从麻杏解毒合剂9味中药（数据库未收录石膏、僵蚕）中筛选出92个候选活性成分，其中麻黄23个、杏仁19个、浙贝母7个、蝉蜕8个、姜黄3个、桔梗7个、枳壳5个、草果8个、豆蔻12个。92个候选活性成分对应1 199个作用靶点。

2.2 疾病靶点预测结果 通过GeneCards数据库检索“Viral pneumonia”，共得到3 473个相关基因。以“Score＞5”为条件进行筛选，满足条件的有971个，以此作为疾病候选靶点基因。

2.3 活性成分-疾病交集靶点结果 应用Venny 2.1在线软件对92个有效成分的1 199个作用靶点与病毒性肺炎的971个疾病靶点取交集，获得52个交集靶点，见图1。

图1 活性成分—疾病交集靶点Venny图

2.4 成分-靶点-疾病相互作用网络构建 采用Cytoscape 3.3.0软件，对中药、活性成分、病毒性肺炎及交集靶点构建活性成分-靶点-疾病网络。在互作网络中，包括154个节点（9味中药、92个化合物节点、52个靶点和1个疾病节点）和947条边，见图2。其中，1个节点的度（Degree）表示网络中和节点相连的线路数。根据Degree由大到小排序，选取前30位，结果见表1。有28个活性成分作用靶点Degree≥10个，提示这些活性成分在整个网络中起枢纽作用。

图2 中药-成分-靶点-疾病互作网络图

表1 中药-成分-靶点-疾病节点Degree值

2.5 麻杏解毒合剂靶点PPI网络的构建与分析 将药物与疾病的52个交集靶点运用String数据库建立麻杏解毒合剂靶点蛋白相互（PPI）网络。取评分值高于0.9，置信度最高的数据，隐藏散点值制作PPI网络图，见图3A。显示该网络涉及52个蛋白质节点和92条连线，平均节点的度为3.54，平均局部聚类系数0.341（P＜1.0～16）。用节点的大小和颜色表示Degree值，节点越大对应的Degree值越大，颜色由红变蓝对应的Degree值也越大；用边的粗细表示Combine score值的大小，边越粗，Combine score值越大。根据Degree≥20的节点制作出前30个关键蛋白节点的条形图，如JUN、MAKP1、MAKP8、APP、ESR1、IL-6等，见图3B，提示这些关键蛋白是网络的核心靶点。

图3 麻杏解毒合剂-病毒肺炎交集靶点蛋白PPI网络

2.6 GO富集与KEGG通路富集分析 将52个交集靶基因导入DAVID在线软件进行GO富集分析，麻杏解毒合剂在体内通过调节52个潜在靶点基因，进而调控48个生物过程，包括氧化应激反应（response to oxidative stress）、缺氧反应（response to hypoxia）、基因表达负调控（negative regulation of gene expression）、血压调节（regulation of blood pressure）、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录正调控（positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡ promoter）、T细胞增殖正调控（positive regulation of T cell proliferation）等，见图4。

图4 GO富集图

KEGG通路富集分析发现麻杏解毒合剂的靶点主要富集在69条信号通路上，其中感染相关通路16条，如Epstein-Barr病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、甲型流感（Influenza A）、单纯疱疹感染（Herpes simplex infection）、HIF-1信号通路（HIF-1 signaling pathway）等。免疫炎症相关7条，如Toll样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）、T细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）等。神经内分泌12条，如心肌细胞的肾上腺素信号传导（Adrenergic signaling in cardiomyocytes）、多巴胺能突触（Dopaminergic synapse）等。细胞功能通路11条，如ErbB信号通路（ErbB signaling pathway）、MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）等。疾病相关通路22条，如癌症通路（Pathways in cancer）、炎性肠病（Inflammatory bowel disease）等。KEGG通路富集的Pathway富集柱状图见图5。

图5 部分KEGG通路富集图

3 讨 论

3.1 麻杏解毒合剂与新冠肺炎 新冠肺炎是一种由病毒感染引起的急性呼吸道传染病，发病迅速，传播很快。根据新冠肺炎流行病学特点，归属于中医学“疫毒”“疫疠”“瘟疫”“温疫”“湿毒疫”等范畴[8-9]。病因为感受“疫疠”之邪，从口鼻而入，首先犯肺，病位在肺；关于病性，不同地区、学者有不同看法，如“寒湿疫”“湿毒疫”“湿疫”等[10]。麻杏解毒合剂是以麻杏石甘汤和升降散化裁而成，方中麻杏石甘汤辛凉宣泄，清肺平喘，用于外感风寒郁而化热，热壅于肺；升降散升清降浊，散风清热，治温病表里三焦之大热。因甘草滋腻碍邪，大黄苦寒泻下伤正气，故去甘草、大黄；加桔梗、浙贝母宣肺化痰，草果、豆蔻温中化浊，共奏辛凉宣肺平喘、解毒清肺化浊之功。麻杏解毒合剂为重庆市新冠肺炎中医诊疗方案推荐的代表方剂。

3.2 麻杏解毒合剂的核心靶点和功能 从表1可见麻黄、豆蔻、草果在中药-成分-靶点-疾病网络中的Degree值最高，表明这3味中药的核心作用。在药物与疾病的52个交集靶点中，如图3所示，JUN、MAPK1、MAPK8、APP、ESR1、IL-6、EGFR、MAPK14、VEGFA等关键靶点，其功能涉氧化应激反应、缺氧反应等。与炎症细胞因子调控相关的MAPK14，NOS2等，总共涉及48个生物过程（见图4），均与疾病、药物靶点密切相关。如有研究发现，麻杏石甘汤能降低重症肺炎患者的炎性反应，改善呼吸功能，减缓病情进展[11]。升降散对脓毒症患者心脏有保护作用，这种保护作用的机制可能与提高抗氧化能力有关[12]。

3.3 麻杏解毒合剂与信号通路 如图5所示，KEGG通路富集了麻杏解毒合剂69条通路，首先是与感染相关通路，如EB病毒感染、甲型流感等。新冠肺炎易诱发低氧血症，HIF-1信号通路在机体对低氧浓度或缺氧应答中至关重要，在缺氧条件下充当了许多缺氧诱导基因的主要调节因子，不仅可以通过降低氧气利用率，而且还可以通过其他刺激物（如一氧化氮或各种生长因子）来诱导一系列的适应性反应[13]。在动物实验中，麻杏石甘汤对流感病毒致感染鼠肺部炎症引起的肺泡、细支气管等正常组织结构有明显的改善作用[14]。其次则是与免疫炎症相关通路，如Toll样受体和NOD样受体信号通路均为固有免疫。作为机体抵抗病原微生物的第一道防线，固有免疫细胞通过模式识别受体识别病原体相关模式分子继而启动下游信号通路，以发挥固有免疫效应，清除入侵的病原体[15-16]。当NOD样受体及Toll样受体信号通路被刺激后可激活干扰素信号通路，进而激动T细胞、B细胞受体信号通路，调动适应性免疫，产生大量的细胞因子[17-18]。通过TNF和NF-κB信号通路的放大作用[19]，Rap1信号通路介入了急性肺损伤[20]。此外，还有与神经内分泌信号相关通路，如调动了肾上腺素信号传导、多巴胺能突触信号等功能。最后，还有与细胞功能通路和疾病相关通路，如参与细胞增殖、分化、转化、凋亡等的MAPK信号通路；与癌症、炎性肠病、类风湿等疾病相关通路等。从上述信号通路可推测，麻杏解毒合剂能改善呼吸功能，提高低氧的适应性反应，调动固有和适应性免疫，减少炎症反应对组织的损伤，同时也影响着细胞的多方面生理功能，参与多种疾病的干预作用。

综上所述，本文借助网络药理学方法探讨了麻杏解毒合剂治疗新冠肺炎的可能机制，为下一步研究提供了思路。本研究也存在着一些不足，一方面尽管笔者检索了多个数据库，但均未检索到石膏和僵蚕的活性成分，尤其石膏是本处方的重要药物，因此对结果会有一定的影响；另一方面因为新冠肺炎是一种新的疾病，现数据库还未收录该疾病的相关靶点，所以本研究选择了病毒性肺炎的靶点来开展研究。