miR-200c及MALAT1在原发性不孕患者子宫内膜组织中的表达及临床意义*

陆月梅 王秀美* 薛晓玲 周丽佳 储巧香

原发性不孕是指未孕育过子女，且婚后有正常性生活女性在未避孕情况下1年未怀孕，原发性不孕发生影响因素有男性方面因素(如精液异常、免疫、性功能等)，也有女性方面因素(如输卵管、子宫、阴道异常等)。由于近年来人们生活节奏加快、精神压力增大、饮食习惯差、饮食结构不科学等，原发性不孕发病率在全球范围内呈逐年上升趋势[1]。对原发性不孕进展中相关因子研究，对患者病情及时评估和有效治疗有重要价值。不孕症发生发展与性激素水平变化密切相关，而microRNA-200c(miR-200c)在子宫内膜癌组织中高表达，能促进肿瘤细胞增殖和侵袭[2-3]。miR-200c在乳腺癌细胞中表达上调，与雌激素受体(estrogen receptor，ER)和细胞间充质转化过程有关[4]。乳腺癌中肺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)表达水平明显高于癌旁组织，MALAT1高表达与ER和孕激素受体(progesterone receptor，PR)水平有关[5]。前列腺癌中MALAT1能与ER、PR相互作用，共同促进肿瘤进展[6]。本研究旨在通过采用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time-polymerase chain reaction，qRT-PCR)技术检测原发性不孕症患者子宫内膜组织中miR-200c和MALAT1水平，分析二者与性激素关系，探究二者在原发性不孕症中的作用和意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年6月至2019年6月南通大学附属海安医院收治的86例原发性不孕患者，年龄23～36岁，平均年龄(26.37±6.24)岁，将其纳入原发性不孕组，另选取同期行诊断性刮宫术的86名正常生育健康女性，年龄24～35岁，平均年龄(27.04±6.01)岁，作为健康对照组。两组年龄比较无差异。本研究经医院伦理委员会批准同意，所有入组者及家属均对研究知情并签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

(1)纳入标准：①根据美国生殖医学会对不孕女性诊断标准[7]确诊为原发性不孕；②3个月内未用任何激素类药物，无妊娠、哺乳和刮宫史；③子宫腔正常、输卵管通畅。

(2)排除标准：①患有身体其他部位疾病；②精神异常；③丈夫精子、精液异常者。

1.3 仪器设备和试剂

采用7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；TR205-10型核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取试剂盒(北京天漠科技开发有限公司)；15750078反转录试剂盒(北京泰泽瑞达科技有限公司)；RR820A型荧光定量PCR试剂盒(日本TAKARA公司)；抗体622101-1 Anti-β-actin(上海恒斐生物科技有限公司)；MA515344 Anti-ER(天津泰泽兴业生物科技有限公司)；MA515316 Anti-PR(天津泰泽兴业生物科技有限公司)。

1.4 样本采集

原发性不孕组患者于月经来潮24 h内，用内膜采集器获取子宫内膜组织；健康对照组在行诊断性刮宫术时收集子宫内膜组织。所取材料一部分用于qRTPCR，另一部分用于western blot实验。所有入组者在入组时清晨(7：00-9：00)空腹状态下采集外周静脉血5 ml，用于激素水平测定。

1.5 检测方法

(1)qRT-PCR法检测子宫内膜组织中miR-200c及MALAT1表达水平。采用Trizol法提取总RNA，反转录呈cDNA后-20 ℃保存，用于qRT-PCR实验。①20 μl反应体系：Premix Ex TaqⅡ 10 μl，cDNA模板2 μl，上、下游引物各0.8 μl，ROX DyeⅡ0.4 μl，dH2O 6 μl；②反应步骤：95 ℃，30 s，1循环，95 ℃、5 s，63 ℃、33 s，40个循环，采用2-∆∆CT法进行miR-200c及MALAT1相对表达量计算，所用引物见表1。

(2)Western blot法检测子宫内膜组织中ER及PR蛋白表达水平。采用Western blot法检测所有入组者子宫内膜组织中ER和PR表达水平，以β-actin蛋白为内参。用Quantity-One软件收集ER、PR及β-actin条带灰度值数据，二者与β-actin比值为各自相对表达水平。

表1 qRT-PCR引物

1.6 血清性激素水平测定

采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法检测入组者血清促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)、雌激素(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、睾酮(testosterone，T)以及催乳素(prolactin，PRL)水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.7 统计学方法

使用SPSS23.0统计软件对研究数据进行分析，计量资料数据符合正态分布，采用均值±标准差()表示，组间比较采用独立样本t检验。计数资料用百分比(%)表示，采用x2检验。采用Pearson法分析miR-200c和MALAT1与E2、P、ER及PR相关性，采用Logistic回归模型分析原发性不孕危险因素，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组一般资料比较

原发性不孕组患者的年龄、体质量指数(body mass index，BMI)与健康对照组相比，差异无统计学意义(t=0.380，t=0.433；P＞0.05)。原发性不孕组患者有避孕史、痛经比例和有家族史比例显著高于健康对照组，差异有统计学意义(x2=15.740，x2=14.606，x2=5.287；P＜0.05)，见表2。

表2 两组临床资料比较[例(%)]

2.2 两组激素水平比较

原发性不孕组患者血清中E2、FSH、LH、T、PRL及子宫内膜组织中ER水平显著高于健康对照组，差异有统计学意义(t=7.159，t=8.007，t=7.739，t=7.471，t=8.867，t=15.264；P＜0.05)；血清P及子宫内膜组织中PR显著低于健康对照组，差异有统计学意义(t=12.728，t=13.961；P＜0.05)，见表3。

表3 两组激素水平比较()

表3 两组激素水平比较()

注：表中E2为雌激素；P为孕酮；FSH为血清促卵泡激素；LH为黄体生成素；T为睾酮 ；PRL为催乳素；ER/β-actin为雌激素受体相对表达量；PR/β-actin为孕激素受体相对表达量

2.3 两组子宫内膜组织中miR-200c和MALAT1表达水平比较

原发性不孕组患者子宫内膜组织中miR-200c和MALAT1表达水平与健康对照组相比均明显升高，两组相比差异有统计学意义(t=22.388，t=19.543；P＜0.05)，见表4。

表4 两组子宫内膜组织中miR-200c和MALAT1表达水平比较

2.4 原发性不孕患者子宫内膜组织中miR-200c和MALAT1表达水平与血清激素水平相关性

原发性不孕患者子宫内膜组织中miR-200c和MALAT1表达水平与P水平无关，与E2、ER水平呈正相关(r=0.354，r=0.541，r=0.426，r=0.492；P＜0.05)，与PR水平呈负相关(r=-0.483，r=-0.395；P＜0.05)，见表5。

2.5 原发性不孕发生危险因素分析

以原发性不孕患者血清E2水平、子宫组织ER、PR、miR-200c及MALAT表达水平为自变量进行Logistic回归分析可知，ER高水平、PR低水平、miR-200c高水平以及MALAT1高水平是原发性不孕发生危险因素(OR=2.678，OR=3.173，OR=3.282，OR=3.094；P＜0.05)，见表6。

表5 子宫内膜组织中miR-200c和MALAT1表达水平与血清各激素水平相关性

表6 原发性不孕发生危险因素Logistic回归分析

3 讨论

有研究表明，家族史、药流史、受孕年龄等在一定程度上影响不孕症的发生[8-9]。本研究结果显示，原发性不孕组患者有避孕史、痛经比例和有家族史比例显著高于健康对照组，提示有避孕史、痛经和家族史可能与原发性不孕发生有关。原发性不孕发病机制复杂多变，如阴道、子宫和卵巢先天性发育异常，阴道、子宫和输卵管炎症，以及输卵管积液，宫颈狭窄及息肉等[10]。临床中若不能及时诊断出病因及患病程度，患者会因无法进行有效治疗而病情加重，对患者精神和生活质量造成危害。目前不孕症相关因子已有少量研究，但探寻更多相关生物标志物对控制患者病情、制定有效治疗方案有一定帮助。

Botelho等[11]研究证实，E2可作为感染引起的不孕症的潜在生物标志物。Kobayashi[12]和Dorostghoal[13]等研究表明，E2和ER刺激子宫内膜细胞增殖，与子宫着床窗口关闭和子宫内膜容受性改变有关。P水平低与不孕有关，临床多用P辅助生殖和治疗不孕症[14]。Petousis等[15]研究报道，不明原因不孕患者子宫内膜组织中PR表达下调，PR可能作为治疗靶点以改善生殖结局。

本研究结果显示，原发性不孕患者血清中E2、ER水平明显高于健康对照组，P、PR水平明显低于健康对照组，提示血清E2、ER水平升高，P、PR水平降低可能与原发性不孕症发生有关，而E2、ER、P及PR可能通过调控子宫内膜容受性，影响受孕进展。

miRNA是一类能稳定存在于细胞和组织中的短链非编码RNA，具有调控功能，能参与多种疾病调控。原发性不孕症与子宫内膜异位症密切相关，Dong等[16]研究发现，miR-191在子宫内膜异位症患者血清中表达水平升高，与子宫内膜异位症向恶性转化有关。Zhang等[17]研究证实，与健康对照组相比，输卵管炎异位妊娠患者体内miR-1247表达水平显著升高，可能是异位妊娠生物标志物。本研究结果显示，miR-200c在原发性不孕患者子宫内膜组织中表达水平显著高于健康对照组，提示miR-200c可能与原发性不孕发生发展有关。Islam等[18]在子宫平滑肌瘤研究中发现，细胞外基质积累中miR-200c水平与ER、PR水平变化有关。Zheng等[19]研究报道，与健康非妊娠和早孕妇女相比，miR-200c在流产和不孕症患者血清中表达水平升高，与子宫内膜容受性降低有关。本研究结果发现，原发性不孕患者子宫内膜组织中miR-200c表达水平与E2、ER水平呈正相关，与血清PR水平呈负相关，提示miR-200c可能通过调控E2、ER及PR水平，影响子宫内膜容受性，参与原发性不孕症进展。具体作用机制还需深入研究。

MALAT1是一种与肿瘤增殖、分化和转移有关的长链非编码RNA。有研究报道，MALAT1在宫颈癌组织中相对表达量明显高于癌旁组织，与肿瘤淋巴结转移有关，可促进宫颈癌细胞增殖[20-21]。上皮性卵巢癌患者血浆中MALAT1表达水平显著高于健康对照组，是患者发生肿瘤细胞低分化、淋巴结转移危险因素[22]。不孕症发生与子宫内膜增殖、着床窗口状态和子宫容受性有关[13]。本研究结果显示，与健康对照组相比，原发性不孕症患者子宫内膜中MALAT1表达水平明显升高，提示MALAT1高表达可能影响原发性不孕发生。有研究表明，MALAT1表达水平与E2、ER及PR水平有关[5-6]。本研究结果显示，原发性不孕患者子宫内膜组织中MALAT1表达水平与E2、ER水平呈正相关，与血清PR水平呈负相关，但具体机制尚需进一步研究。MALAT1可能通过影响E2、ER及PR水平，促进子宫内膜增殖，抑制子宫内膜容受性，影响患者受孕进程[23]。本研究还发现，ER高水平、PR低水平、miR-200c高水平、MALAT1高水平是原发性不孕发生危险因素，提示ER、PR、miR-200c及MALAT1均可能作为原发性不孕生物标志物，用于评估疾病发生发展，为患者病情诊断和治疗方案确定提供一定帮助。

4 结论

原发性不孕患者子宫内膜组织中miR-200c、MALAT1表达水平明显高于健康对照组，与E2、ER和PR水平变化有关，可能通过影响E2、ER和PR水平参与原发性不孕发生发展。但由于本研究样本量较少，方法较为基础单一，具体作用机制还需进行大量实验深入研究。