乳腺癌患者外周血miR-34a表达变化的临床意义

王庆月 张晨辉 陈钰

乳腺癌是我国发病率居首的女性恶性肿瘤，约20%乳腺癌患者首次就诊时已经发展至局部晚期，在手术前进行新辅助化疗是临床常用的治疗手段［1-2］。病理完全缓解（pathologic complete response，pCR）是评价新辅助化疗效果的重要指标，乔伟强等人通过Meta 分析研究发现新辅助化疗后获得pCR 的乳腺癌患者5年总生存率和无病生存率均明显高于未获得pCR 的患者［3］。在临床实践中，手术后病理检查是评估pCR 的金标准，但是具有一定滞后性。在手术前预测新辅助化疗的疗效、筛选出能够获得pCR 的乳腺癌患者，对于选择适用新辅助化疗的患者具有指导意义。癌细胞对化疗药物的敏感性是影响化疗效果的重要因素，多种微小RNA（microRNA，miR）被证实参与癌细胞化疗敏感性的调控［4-6］。miR-34a 是一种具有抑癌作用的微小RNA，乳腺癌病灶内miR-34a 表达减少［7］，过表达miR-34a 能够抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭［8］。因此，本研究将分析乳腺癌患者外周血miR-34a 表达与临床病理特征及新辅助化疗pCR 的相关性，旨在为寻找新辅助化疗pCR 的早期预测标志物提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年5月至2019年5月期间在本院接受新辅助化疗的乳腺癌患者作为乳腺癌组，纳入标准：①经穿刺活检诊断为浸润性乳腺癌，临床分期ⅡB～Ⅲ期；②接受TE 或TEC 方案新辅助化疗；③临床病理资料完整；④术前留取外周抗凝血样本。排除标准：①入组前接受过放化疗或其他抗肿瘤治疗；②妊娠或哺乳期患者；③既往有其他恶性肿瘤病史。另取同期体检的健康志愿者作为对照组。乳腺癌组共142 例，年龄34～64 岁、平均（51.32±9.29）岁，BMI（23.12±6.23）kg/m2；对照组共86 例，年龄33～60 岁、平均（49.95±11.32）岁，BMI（23.44±7.14）kg/m2。两组间一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 外周血miR-34a 表达水平的检测

取乳腺癌组和对照组的外周抗凝血标本，采用miR 提取分离试剂盒（北京天根公司，批号DP501）分离miR，而后采用miR cDNA 第一链合成试剂盒（北京天根公司，批号KR211）将静脉血中提取得到的miR 反转录为cDNA，最后采用miR荧光定量检测试剂盒（北京天根公司，批号FP401）在荧光定量PCR 仪进行荧光定量PCR 检测，反应结束后生成循环曲线并得到循环阈值，以U6 为内参，计算miR-34a 的表达量。

1.3 乳腺癌中bcl-2、CCND1、Notch1 表达的检测

取乳腺癌组织，采用RIPA 裂解液对组织进行匀浆并提取蛋白，采用BCA 试剂盒测定蛋白含量，取含有20 μg 蛋白的样本进行western blot 检测，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳后电转移至PVDF膜，1∶1 000 稀释的bcl-2、CCND1、Notch1 一抗或1∶5 000 稀释的β-actin 一抗4℃孵育PVDF 膜过夜，1∶2 000 稀释的二抗室温孵育PVDF 膜1 h，采用ECL 显影液在凝胶成像系统中曝光得到bcl-2、CCND1、Notch1、β-actin 的蛋白条带，计算bcl-2、CCND1、Notch1 与β-actin 灰度值的比值作为蛋白表达水平。

1.4 新辅助化疗方案及pCR 的判断

乳腺癌患者接受TE 或TEC 方案新辅助化疗。化疗两个周期后，进行磁共振检查并根据RECIST1.1 标准判断疗效，疗效达到稳定（SD）、进展（PD）、完全缓解（CR）的患者进行根治性手术，疗效达到部分缓解（PR）继续行两个周期TEC方案新辅助化疗后进行根治性手术。根治性手术后进行病理检查，乳腺原发灶和转移区域淋巴结未找到恶性肿瘤的组织学证据认为获得pCR。

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据统计分析，计量资料经方差齐性检验、符合方差齐性并以（±s）表示，两组间比较采用t检验，3 组间比较采用方差分析；miR-34a 预测新辅助化疗pCR 采用ROC 曲线分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组与对照组外周血miR-34a表达的比较

与对照组比较，乳腺癌组患者外周血miR-34a的表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 乳腺癌组中不同病理特征患者外周血miR-34a 表达的比较

乳腺癌组中不同年龄、月经状态患者比较，外周血miR-34a 表达水平的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同T 分期、N 分期、临床分期、Ki-67 表达、分子分型患者比较，外周血miR-34a 表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 乳腺癌组中不同病理特征患者外周血miR-34a 表达的比较（±s）Table 1 Comparison of miR-34a expression in peripheral blood of patients with different pathological characteristics in breast cancer group（±s）

表1 乳腺癌组中不同病理特征患者外周血miR-34a 表达的比较（±s）Table 1 Comparison of miR-34a expression in peripheral blood of patients with different pathological characteristics in breast cancer group（±s）

临床病理特征年龄月经状态T 分期N 分期临床分期Ki-67分子分型分类＜50 岁≥50 岁绝经前绝经后T1-2 T3-4 N0-1 N2-3 IIB III阴性阳性Luminal 型HER2 型三阴型n 61 81 84 58 101 41 109 33 95 47 31 111 63 38 41 miR-34a 0.75±0.22 0.70±0.18 0.74±0.21 0.69±0.19 0.77±0.25 0.60±0.17 0.76±0.24 0.60±0.16 0.77±0.25 0.62±0.15 0.47±0.16 0.79±0.24 0.75±0.24 0.68±0.25 0.46±0.14 t/F 值1.489 1.449 3.991 3.591 3.786 6.993 P 值0.139 0.150 0.000 0.001＜0.001＜0.001 22.342＜0.001

2.3 乳腺癌组中不同miR-34a 表达水平患者乳腺癌病灶内bcl-2、CCND1、Notch1 的比较

计算乳腺癌患者外周血miR-34a 表达的中位数，比较不同miR-34a 表达水平患者乳腺癌病灶内bcl-2、CCND1、Notch1 表达水平的差异可知：miR-34a 表达≥中位数患者乳腺癌病灶内bcl-2、CCND1、Notch1 的表达水平低于miR-34a 表达＜中位数的乳腺癌患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表2。

2.4 乳腺癌组中pCR与非pCR患者外周血miR-34a表达的比较

与乳腺癌组中pCR 患者比较，非pCR 患者外周血miR-34a 的表达水平（0.66±0.16）明显降低于pCR 患者外周血miR-34a 的水平（0.85±0.17），差异有统计学意义（t=3.660，P＜0.05）。

图1 乳腺癌组中不同miR-34a 表达水平患者乳腺癌病灶内bcl-2、CCND1、Notch1 的蛋白条带Figure 1 Protein bands of bcl-2，CCND1，Notch1 in breast cancer lesion of patients with different miR-34a expression level in breast cancer group

表2 乳腺癌组中不同miR-34a 表达水平患者乳腺癌病灶内bcl-2、CCND1、Notch1 的比较（±s）Table 2 Comparison of bcl-2，CCND1，Notch1 expression levels in breast cancer lesion of patients with different miR-34a expression level in breast cancer group（±s）

表2 乳腺癌组中不同miR-34a 表达水平患者乳腺癌病灶内bcl-2、CCND1、Notch1 的比较（±s）Table 2 Comparison of bcl-2，CCND1，Notch1 expression levels in breast cancer lesion of patients with different miR-34a expression level in breast cancer group（±s）

miR-34a 表达水平≥中位数＜中位数t 值P 值n 71 71 Bcl-2 0.67±0.16 1.14±0.32 9.938 0.000 CCND1 0.58±0.12 0.94±0.27 7.582 0.000 Notch1 0.55±0.14 1.22±0.36 13.274 0.000

2.5 miR-34a 预测新辅助化疗pCR 的ROC 曲线分析

miR-34a 预测新辅助化疗pCR 的ROC 曲线下面积为0.807（95%CI：0.729～0.886，P＜0.05）。根据约登指数最大值确定miR-34a 预测pCR 的最佳截断值为0.735，灵敏度为82.93%、特异性为69.31%。见图2。

图2 miR-34a 预测新辅助化疗pCR 的ROC 曲线Figure 2 ROC curve of miR-34a in predicting PCR of neoadjuvant chemotherapy

3 讨论

新辅助化疗是乳腺癌重要的治疗手段，化疗后获得pCR 对改善远期预后具有积极意义，但目前关于乳腺癌化疗敏感性的调控机制尚不十分清楚。近些年，miR 在乳腺癌发病中的作用受到越来越多关注，相关临床研究发现，乳腺癌组织中存在多种miR 的异常表达［9-10］；相关基础研究发现，miR对乳腺癌细胞的恶性生物学行为及放化疗敏感性具有调控作用［11］。

miR-34a 具有抑癌作用，已有研究报道，乳腺癌、胃癌、结直肠癌、口腔癌等恶性肿瘤中miR-34a的表达减少［7，12-14］。本研究结果与既往国内外学者报道的乳腺癌中miR-34a 低表达结果［7，12］一致。乳腺癌中miR-34a 生物学功能相关的实验研究发现，miR-34a 对乳腺癌细胞的增殖、侵袭具有抑制作用［8，15］。在乳腺癌病情发展过程中，癌细胞不断增殖、侵袭能够造成肿瘤病灶增大、促进肿瘤浸润及远处转移。本研究进一步观察结果表明miR-34a 低表达与乳腺癌多项病理特征的恶化有关，与之相关的可能机制是miR-34a 表达减少后、相应的抑癌作用减弱，进而促进了乳腺癌的发展。

miR-34a 的抑癌作用与其对多种原癌基因表达的抑制作用有关，李志华［9］的研究发现miR-34a 能够抑制乳腺癌细胞中bcl-2、CCND1、Notch1 三种基因的表达。bcl-2、CCND1、Notch1 是目前已知具有促增殖作用的原癌基因，在乳腺癌病灶内均呈高表达的趋势，能够通过阻碍细胞凋亡、加速细胞周期进程、促进细胞有丝分裂等方式促进细胞增殖。为了进一步阐明miR-34a 在乳腺癌发展中的作用及可能机制，本研究分析结果与miR-34a 在细胞实验中抑制bcl-2、CCND1、Notch1 表达的作用吻合，表明miR-34a 低表达在乳腺癌发病及病理进程中的作用可能与增加多种原癌基因的表达有关［16］。

本研究结果提示miR-34a 的低表达可能影响新辅助化疗效果、与患者未能获得pCR 有关。ROC曲线分析表明miR-34a 有望成为预测乳腺癌新辅助化疗pCR 的标志物。

综上所述，乳腺癌患者外周血miR-34a表达减少且与病理特征恶化、新辅助化疗未能获得pCR 有关，未来miR-34a 有望成为乳腺癌诊疗及新辅助化疗效果预测的新靶点，但本研究的样本量相对较小且未对接受新辅助化疗的乳腺癌患者进行术后生存的长期随访，今后应继续收集病例并进行生存随访，以阐明miR-34a 在乳腺癌发生发展中的作用。