高效液相色谱法测定辣椒粉中苏丹红I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的不确定度评定

宗凌丽 应月 孙瑞

摘 要：本文采用液相色谱法对辣椒粉中苏丹红含量测定进行不确定度研究，建立不确定度评定的数学模型，对检测过程中各来源产生的不确定度进行分析，得到该方法的扩展不确定度。结果表明辣椒粉中苏丹红不确定度评定结果为苏丹红I0.896±0.046 4 mg·kg-1、苏丹红Ⅱ0.701±0.018 8 mg·kg-1、苏丹红Ⅲ0.847±0.021 5 mg·kg-1、苏丹红Ⅳ0.624±0.018 3 mg·kg-1。

关键词：辣椒粉;苏丹红I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ;不确定度

Abstract：In this paper， the uncertainty of determination of Sudan red in pepper powder was studied by HPLC， and the mathematical model of uncertainty evaluation was established. The uncertainty of each source in the detection process was analyzed， and the expanded uncertainty of this method was obtained. The results showed that the uncertainty evaluation results of Sudan red in pepper powder were Sudan I 0.896 ± 0.046 4 mg·kg-1， Sudan II 0.701±0.018 8 mg·kg-1， Sudan III

0.847 ± 0.021 5 mg·kg-1， Sudan IV 0.624 ± 0.018 3 mg·kg-1.

Key words：Chili powder; Sudan I， II， III， IV; Uncertainty

中圖分类号：O657.7

苏丹红是一种人工合成的亲脂性偶氮染料，主要包括I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ4种类型。使用苏丹红染色后的食品颜色非常鲜艳且不易褪色，能引起人们强烈的食欲，一些不法企业把苏丹红添加到食品中。经毒理学研究表明，苏丹红具有致突变性和致癌性，苏丹红I在人类肝细胞研究中显示具有可能致癌的特性，在我国禁止使用于食品中。在发现苏丹红在人体内代谢产物为可能致癌的胺类物质后，欧盟等国家已禁止其作为色素在食品中添加[1-2]。因此对苏丹红的检测技术提出了很高的要求[3]。测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性与测量结果的参数，也是对检测数据真实性的客观反映和判定测量结果可靠程度的依据。

本实验室研究了GB/T 19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法 高效液相色谱法》测定食品中苏丹红的不确定度，参考JJ 1059.1-2012《测量不确定评定与表示》[4]和JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》[5]测量和评定其不确定度，为检测实验室质量控制提供科学、准确的依据，为食品中的苏丹红含量测定提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

苏丹红I标准物质（阿尔塔，100 μg·mL-1，纯度99.6%）、苏丹红Ⅱ标准物质（曼哈格，100 μg·mL-1，纯度85.0%）、苏丹红Ⅲ标准物质（曼哈格，100 μg·mL-1，

纯度90.7%）和苏丹红Ⅳ标准物质（曼哈格，100 μg·mL-1，

纯度78.6%）;玻璃量器：经检定均为A级;丙酮、乙腈、正己烷均为色谱纯;无水硫酸钠为分析纯。

1.1.2 仪器

Agilent1260液相色谱仪（DAD检测器），美国安捷伦科技有限公司;METTLER-TOLEDO ME503T电子天平，梅特勒-托利多公司;色谱柱：Agilent  Eclipse plus-C18 4.6 mm×150 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司。

1.1.3 测定条件

测定的环境条件：温度≤30 ℃，相对湿度≤50%。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理

红辣椒粉等粉状样品：称取1～5 g（准确至0.001 g）

样品于三角瓶中，加入10～30 mL正己烷，超声

5 min，过滤，用10 mL正己烷洗涤残渣数次，至洗出液无色，合并正己烷液，用旋转蒸发仪浓缩至5 mL以下，慢慢加入氧化铝层析柱中，为保证层析效果，在柱中保持正己烷液面为2 mm左右时上样，在全程的层析过程中不应使柱干涸，用正己烷少量多次淋洗浓缩瓶，一并注入层析柱。控制氧化铝表层吸附的色素带易小于0.5 cm，待样液完全流出后，视样品中含油类杂质的多少用10～30 mL正己烷洗柱，直至流出液无色，弃去全部正己烷淋洗液，用含5%丙酮的正己烷液60 mL洗脱，收集、浓缩后，用丙酮转移并定容至5 mL，经0.45 ?m有机滤膜过滤后待测。

1.2.2 色谱条件

用反相高效液相色谱——紫外可见光检测器进行色谱分析，检测波长：苏丹红I 478 nm;苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ520 nm，其峰面积与标准系列比较定量。

1.2.3 检测方法

标准溶液的配制：取苏丹红I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准溶液各1 mL，用乙腈稀释配制成标准工作液。以保留时间定性、峰面积定量、外标法计算苏丹红含量。

1.2.4 建立数学模型

测量不确定度数学模型如下所示：

（1）

式（1）中，X为供试样品中苏丹红含量，mg·kg-1;C为供试溶液中苏丹红的浓度，μg·mL-1;V为供试品定容的总体积，mL;m为供试样品质量，g。

2 不确定度来源分析?

2.1 不确定度的来源

液相色谱法测定食品中苏丹红含量其不确定度来源主要有标准溶液及配制过程、样品称样量、样品最终定容体积、色谱峰面积、回收率等引入的不确定度。

2.2 标准溶液及其配制过程中引入的相对标准不确定度

2.2.1 标准溶液引入的相对不确定度urel（C1）

根据苏丹红I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ标准物质证书，苏丹红I标准物质（阿尔塔，100 μg·ml-1，纯度99.6%）、苏丹红Ⅱ标准物质（曼哈格，100 μg·mL-1，纯度85.0%）、苏丹红Ⅲ标准物质（曼哈格，100 μg·mL-1，纯度90.7%）和苏丹红Ⅳ标准物质（曼哈格，

100 μg·mL-1，纯度78.6%），其标准溶液不确定度u（C1），见表1。根据公式（1）得到苏丹红各组分的相对不确定度urel（C1），按正态分布计算，k=2，结果见表1。

2.2.2 標准溶液配制过程引入的相对标准不确定度urel（C0）

用1.0 mL移液管移取苏丹红I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ准溶液

1.0 mL，置于洁净100 mL容量瓶中，乙腈定容，混匀，浓度为1.0 μg·mL-1。根据JJG 196-2006《常用玻璃量器检定规程》，用容量允差计算不确定度，计算标准溶液稀释过程引入的不确定度。

（1）玻璃量器引入的相对标准不确定度u（V）。

1.0 mL移液管校准容量允差为±0.007 mL，假设为均匀分布，其标准不确定度为：

100 mL容量瓶校准容量允差为±0.10 mL，假设为均匀分布，其标准不确定度为

（2）环境温度变化引入的不确定度u（t）。实验室环境温度变化在±3 ℃范围中?T=3，溶剂的膨胀系数a=1.37×10-3，则温度变化引入的不确定度：

合成不确定度

相对合成不确定

根据公式（2）计算有苏丹红标准溶液配制所引入的相对不确定度urel（C0）。

（2）

2.3 样品制备过程中引入的不确定度

2.3.1 样品称样量引入的相对不确定度urel（m）

称取1.000 g样品，使用天平的最大允许误差为

1 mg，以1 g称样量计算，按均匀分布计算，k=。由称量引入的相对不确定度为：

2.3.2 样品最终定容体积的相对标准不确定度urel（V）

5.0 mL容量瓶允差?（V）为±0.02 mL，按矩形分布，则5.0 mL容量瓶不确定度为：

环境温度变化引入的不确定度：

样品最终定容体积的相对不确定度

2.3.3 色谱峰面积引入的相对标准不确定度urel（A0）

分别对各组分的苏丹红标准溶液（浓度为

1.0 μg·mL-1）进行6次平行测定，得到峰面积，结果见表2。根据公式（3）计算苏丹红准溶液色谱峰面积引入的标准偏差u（A0）和相对标准不确定度urel（A0），结果见表3。

（3）

（4）

2.3.4 回收率引起的相对标准不确定度u（R）

称取辣椒粉样品6份，按1 mg·kg-1水平添加苏丹红标准溶液，进行6次加标试验，根据贝赛尔公式计算标准偏差S（R）和测量平均值R，根据

计算回收率相对标准不确定度urel（R），结果见表4。

2.4 合成不确定度

根据以上不确定度评定过程，合成食品中苏丹红测定结果的相对标准不确定度，见表5，结果如下：

2.5 扩展不确定度u

取k=2（置信度为95%）时，计算苏丹红的扩展不确定度u，结果见表6。

2.6 测量结果

当取样量为1.0 g，k=2（置信度为95%）时，液色谱法检测辣椒粉中苏丹红I、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ，当测得浓度为苏丹红I 0.896 mg·kg-1、苏丹红Ⅱ0.701 mg·kg-1、苏丹红Ⅲ0.847 mg·kg-1、苏丹红Ⅳ0.624 mg·kg-1，其扩展不确定度为苏丹红I

0.046 4 mg·kg-1、苏丹红Ⅱ 0.018 8 mg·kg-1、苏丹红Ⅲ0.021 5 mg·kg-1、苏丹红Ⅳ0.018 3 mg·kg-1。测定结果表示为苏丹红I0.896±0.046 4 mg·kg-1、苏丹红Ⅱ0.701±

0.018 8 mg·kg-1、苏丹红Ⅲ0.847±0.021 5 mg·kg-1、

苏丹红Ⅳ0.624±0.018 3 mg·kg-1。

3 结论

本实验采用液相色谱法对辣椒粉中苏丹红含量进行了测定，结合实验过程及计算结果可知，标准溶液及标准溶液配制引入的不确定度是本研究方法测量不确定度的主要来源，其次是样品的定容体积、测定结果峰面积、回收率等引入的不确定度。因此需控制的关键环节主要包括随时调整仪器使其达到最佳状态，同时规范标准溶液配制过程，分析人员应熟练掌握样品各项处理步骤，以提高检测的准确性，保证实验结果准确、稳定、可靠，从而减少测定结果的不确定度。

参考文献：

[1]魏明，侯进.苏丹红的毒性研究进展[J].医学综述，2012，18（21）：3619-3621.

[2]宋雁，李宁.食品中苏丹红的危险性评估[J].环境卫生学杂志，2005，32（3）：129-132.

[3]勾华，令狐燕，罗宿星，等.食品中苏丹红的检测方法研究进展[J].江苏农业科学，2012，40（11）：315-317.

[4]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.JJF1059.1-2012 测量不确定度评定与表示[S].北京：中国计量出版社，2012.

[5]国家质量监督检验检疫总局.JJG 196-2006 常用玻璃量器检定规程[S].北京：中国计量出版社，2006.