基于网络药理学的“黄连-三七”药对抗2型糖尿病作用机制*

田会东，王静，郭丽娜，贾明璐，陈雪平，王瑞

(1.河南省漯河市中心医院药学部，漯河 462000；2.漯河医学高等专科学校，漯河 462000)

近年来，随着我国人口老龄化与生活方式及饮食结构的改变，糖尿病已经从少见病变成一个流行病，2型糖尿病患病率持续攀升[1]。据最新数据显示，我国成人糖尿病的患病率达10.9%，患病人数居世界之首[2]。2型糖尿病及其并发症严重危害人类健康，并给社会带来巨大的经济负担。因此，抗2型糖尿病药物的研究，已经成为当今医药研究领域的热点和难点。中药因具有“多成分-多靶点-多通路”发挥整体协同作用的特点，在治疗糖尿病及其并发症等疾病方面具有得天独厚的优势。中医认为，2型糖尿病及其并发症是由于机体燥热内盛、炼液为痰、血流滞涩所致，治疗应以清热燥湿、化痰通络为主[3]。黄连是毛茛科植物黄连(CoptischinensisFranch.)、三角叶黄连(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云连(CoptisteetaWall.)的干燥根茎，性寒、味苦，具有清热润燥的疗效[4]；三七为五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]的干燥根和根茎，性温、味甘，具有活血通络之效[5]；二者配伍正体现清热润燥、益气活血法治疗“消渴症”的基本方法。现代中医临床发现，黄连-三七在很多中药处方中都有体现，是中医治疗糖尿病的常用药对[6- 7]。然而，由于中药多成分多靶点等特点，黄连-三七药对抗2型糖尿病的作用机制尚未完全阐明。网络药理学是一种新的研究药物作用机制的方法，广泛应用于中药复方的研究，为中药作用机制的研究开辟了新的思路[8]。因此，本研究采用网络药理学方法，对“黄连-三七”药对主要活性物质、作用靶点及信号通路对其抗2型糖尿病的作用机制进行探索，旨在为黄连-三七抗2型糖尿病的进一步探索提供科学依据。

1 材料与方法

1.1筛选活性成分及相应靶点 分别以黄连、三七为关键词，从中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP)(http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php) 中获取所有化学成分。把口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-like，DL)≥0.18作为筛选条件[9]，从而得到活性成分。其中OB和DL是筛选活性成分的重要指标，OB、DL值越高，表明其越有可能被开发成为药物[10-11]。活性成分的作用靶点从TCMSP数据库中获得，把靶点名称输入UniProt数据库(https：//www.uniprot.org/)，获得其相应靶点的人源的靶点基因名称。

1.2构建“活性成分-靶点蛋白”网络 将黄连-三七药对筛选出的活性成分和UniProt数据库获得的人源靶点导入Cytoscape 3.6.1版软件，运用Network Analyzer插件分析构建“活性成分-靶点蛋白”的网络图。

1.3构建抗2型糖尿病靶点蛋白互作(protein protein interaction,PPI)网络 运用比较毒物基因组学数据库(comparative toxicogenomics database,CTD)(http：//ctdbase.org/)和治疗靶点数据库(therapeutic target database,TTD)(https：//db.idrblab.org/ttd/)，以“Type 2 Diabetes”为关键词，检索与2型糖尿病相关的靶点，将得到的靶点基因输入STRING在线分析平台(https：//string-db.org/)，选择分值大于0.7(高置信度评分)[12]，预测靶点与靶点之间的相互作用关系，构建抗2型糖尿病靶点PPI网络图。

1.4网络合并 运用Cytoscape 3.6.1版软件中的Merge功能将活性成分-靶点网络和抗2型糖尿病PPI网络合并，观察是否有交集网络。有交集的蛋白靶点可能是抗2型糖尿病的关键靶点。

1.5通路富集分析 运用DAVID6.8数据库对黄连-三七抗2型糖尿病靶点蛋白，进行基因的本体(gene ontology，GO)生物学过程富集分析和KEGG代谢通路富集分析，并以P<0.05作为筛选条件，结果用在线制图平台Omishare Tools可视化处理，进一步阐明靶点蛋白在信号通路中的作用。

2 结果

2.1主要活性成分 文献[13]，皂苷类化合物口服，会被代谢生成次生皂苷或苷元，而真正在体内发挥疗效的多为次生苷或苷元。TCMSP 数据库对此以“皂苷-qt”表示，为准确模拟化合物在体内的真实情况，本研究对皂苷类化合物也以后缀qt 的形式进行描述。通过TCMSP数据库共获得167个黄连-三七对药的已知成分，黄连成分有48个，三七成分有119个；以OB≥30%和DL≥0.18作为筛选条件获得20个成分，其中黄连14个，三七7个，共有相同化合物1个。20个化合物中有3个化合物在TCMSP数据库没有筛选到相关作用靶点。因此，本研究共纳入黄连-三七对药的17个成分作为候选化合物，如表1所示。

2.2“活性成分-靶点”网络图构建 从UniProt数据库得到人源靶点基因共116个，将活性成分与作用靶点通过Cytoscape 3.6.1构建成网络图，如图1所示。图1包含133个节点(17个活性成分和116个相关靶点)和261条线，其正八边形代表活性成分，三角形代表相关靶点，线代表活性成分与相关靶点的关系。据报道，度值(degree)和介数值的节点(betweenness)与活性成分的重要性呈正相关，即其值越大，相应的节点在此网络图中越重要[14]。结果显示，槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、氢化小檗碱[(R)-canadine]等化合物和前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、前列腺素G/H合成酶1(prostaglandin-endoperoxide synthase 1,PTGS1)、5α钠通道蛋白、核受体激活剂2等靶点蛋白在网络图中具有枢纽作用，可能是关键的活性成分和靶点蛋白。这也充分说明了黄连-三七药对是以多成分、多靶点协同作用的特点。

表1 黄连-三七药对筛选后得到的17个活性成分

图1 活性成分-靶点网络图

2.3抗2型糖尿病靶点PPI网络构建 在TTD数据库检索到抗2型糖尿病靶点75个，其中具有人源基因的靶点53个，在CTD数据库中检索到有直接证据来源的靶点211个，将这些靶点输入STRING在线分析平台，从而构建抗2型糖尿病靶点PPI网络，如图2所示。

2.4合并网络 运用Cytoscape 3.6.1版软件中的Merge功能将活性成分-靶点网络和抗2型糖尿病靶点PPI网络合并，获得交集网络图，见图3。从而得到黄连-三七药对发挥抗2型糖尿病作用的化合物15个，包括槲皮素、β-谷甾醇、黄连碱、巴马汀、小檗浸碱等；关键靶点19个，包括胰岛素受体、前列腺素G/H合成酶2、二肽基肽酶IV、肠道麦芽糖酶-葡糖淀粉酶、凋亡调节因子Bcl-2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ等，见表2。

图2 抗2型糖尿病靶点PPI网络

2.5通路富集分析 运用DAVID平台进行GO功能富集分析得到111个GO条目(P<0.05)，其中生物过程(biological process,BP)条目92个，细胞组成(cellular component,CC)条目12个，分子功能(molecular function,MF)相关的条目7个，见图 4。KEGG通路富集，筛选出21条信号通路(P<0.05)，涉及HIF-1信号通路、胰岛素抵抗通路、脂肪细胞脂解调控通路、PI3K-Akt信号通路等，见图5。

图3 抗2型糖尿病作用活性成分-靶点网络

其中准确度最高(P最小)的通路为HIF-1信号通路。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是由α和β亚单位组成一种异源二聚体，属于转录因子碱性螺旋-环-螺旋家族蛋白。HIF与细胞和组织内的能量代谢有关，在缺氧条件下，可上调糖酵解途径，降低线粒体功能来维持细胞代谢平衡，并且HIF还参与肝内糖类和脂质代谢[15]。由DAVID6.8平台富集的HIF-1信号通路图可知(图6)，黄连-三七通过作用于EGFR、IL-6、HMOX1、bcl-2、NOS3、NOS2、INSR等7个靶蛋白调控HIF-1信号通路，起到抗2型糖尿病及其并发症的作用。

表2 核心靶点信息

图4 核心靶点GO富集分析

图5 核心靶点GO富集分析

3 讨论

中医药学有相对完备的理论基础，在防治糖尿病方面具有优势，中药能有效降低糖尿病的发病率已逐渐得到验证[16]。本研究采用网络药理学方法预测了黄连-三七对药抗2型糖尿病的主要活性成分及潜在分子作用机制。由抗2型糖尿病作用活性成分-靶点网络可知，15种成分能对2型糖尿病的相关靶点产生作用，其中6种来自三七，10种来自黄连，槲皮素是黄连和三七的共有成分。据报道槲皮素具有显著的降糖功效，可通过降低大鼠血清抵抗素从而改善胰岛素抵抗，并对空腹血糖、空腹胰岛素水平有直接降低作用[17]。这也为两药联合抗2型糖尿病的合理性提供理论依据。

从交集网络靶点可知，黄连-三七抗2型糖尿病是多靶点协同作用的结果。研究证实，IL-6可促进肝脏合成超敏C反应蛋白(hs-CRP)等急性时相蛋白，促进炎症发生，是2型糖尿病的独立影响因素之一[18]；抑制二肽基肽酶4(dipeptidyl-peptidase 4,DPP4)，可以阻断对GLP-1的降解，因此增加了体内内源性GLP-1水平和活性，从而促进胰岛素分泌[19]；过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)基因定位予3p25，属于转录因子的核激素受体超家族，在调节胰岛素敏感性方面具有重要作用[20]。这些研究报道部分预示着通过网络药理学预测黄连-三七药对作用靶点和通路的可行性，可以把IL6、PTGS2、DPP4、SCD、PPARG等19个关键靶点作为黄连-三七抗2糖尿病的潜在作用靶点深入研究其分子作用机制。

图6 HIF-1信号通路

从GO富集分析可知，靶点主要富集在BP(生物过程)环节，如氧化应激，炎症应答，细胞对镉离子反应等；KEGG通路富集分析发现HIF-1信号通路、胰岛素抵抗通路、脂肪细胞脂解调控通路、PI3K-Akt信号通路等与2型糖尿病密切相关，其中胰岛素抵抗通路直接与糖尿病相关，表明黄连-三七具有良好的抗2型糖尿病效果。HIF-1信号通路准确度最高(P=1.0×10-7)，是黄连-三七主要抗2型糖尿病途径。研究表明，缺氧贯穿于糖尿病并发症发病机制的始终[21]。HIF-1α作为调节细胞内氧代谢的关键因子之一，是目前发现的唯一能在特异性缺氧状态下发挥活性的转录因子，对糖尿病及其并发症的发生、发展起促进作用[22-23]。本研究发现黄连-三七能作用于HIF-1信号通路上EGFR、IL-6、HMOX1、bcl-2、NOS3、NOS2和INSR 7个靶点，证明黄连-三七的抗2型糖尿病作用可通过调控HIF-1信号通路实现。Akt是PI3K通路末端重要的靶蛋白，PI3K-Akt通路在胰岛素调节血糖稳定方面发挥作用，孟昭杰[24]发现黄连素能上调糖尿病患者受损的Akt活性，促进GLUT4转位，从而改善胰岛素抵抗，这与本研究富集在PI3K-Akt通路的结论是吻合的。叉头转录因子(FoxO)是体内一重要的转录因子，已证实与糖代谢密切相关[25]；据王水秀等[26]报道，NF-κB信号通路的活化与炎症反应及胰岛素抵抗的发生密切相关；这些通路也可能是黄连-三七抗2型糖尿病的主要途径之一。

本研究首次采用网络药理学的方法对“黄连-三七”药对抗2型糖尿病的复杂机制进行了探究，成功预测了黄连-三七药对抗2型糖尿病的主要活性成分、作用靶点和相关信号通路，体现了中药复方多成分、多靶点、多通路的特点，为进一步深入探讨作用机制奠定基础，同时也为中药复方治疗2型糖尿病的物质基础和作用机制提供了借鉴。诚然，网络药理是一种新兴的研究方法，本研究的结论仍存在局限性，尚需要基础和临床药理试验的进一步验证。