DAB2在肝癌中表达及临床意义的研究

唐澄海

广西壮族自治区南溪山医院病理科，广西桂林541002

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是目前世界范围内发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康和生命安全[1]。由于HCC发病隐匿、进展迅速，大多数患者在确诊时已经发展到HCC的晚期，治疗效果及预后较差。因此，亟需深入研究HCC的发病机制，了解HCC的发病机理，对于提高HCC的治疗和预后具有重要意义。基因表达及调控紊乱是癌症发生的基础机制之一。早期的研究发现，残疾基因同源物2（disabled homolog 2，DAB2）在多种癌症组织中异常表达，包括肺癌[2]、宫颈癌[3]、口腔鳞状细胞癌[4]等。但是，目前关于DAB2在HCC中的研究尚未见报道。该研究2017年1月—2018年3月间于该院就诊的51例HCC患者为研究对象，对患者肝癌及癌旁组织中的DAB2的表达及临床关系进行初步的研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

于该院就诊的51例肝癌患者为研究对象，其中男28例，女23例；年龄29～78岁，平均年龄(55.00±12.96)岁。同时，收集患者的肿瘤分期、体积、淋巴结转移、远端转移、分化程度、血管侵袭的信息及肝癌和癌旁的组织样本，用于后续实验研究。该研究经该院医学伦理委员会批准进行。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①患者经病理切片确认为HCC；②患者年龄＞18周岁；③首次确诊为HCC；④确诊后未接受其他的放化疗治疗；⑤临床资料完善且同意参与该研究计划。

排除标准：①合并患有其他肿瘤；②先天性的肝脏发育或功能不全；③合并患有其他传染性疾病；④临床资料不完善。

1.3 荧光定量PCR（RT-qPCR）

取0.05 g的组织样品，采用TRIzol试剂提取组织的总RNA，紫外分光光度计对总RNA进行定量。取0.5μg RNA为模板，采用Takara的反转录试剂盒将其反转录为cDNA。随后，以cDNA为模板，在Bio-Rad C1000上进行基因扩增反应，反应条件为：95℃，30 s；40个循环的95℃，10 s，58℃，20 s。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt方法分析DAB2的相对表达水平。RT-qPCR的引物设计如下：DAB2，正向，5'-GTGTTCACGCAAGAACAGACAG-3'；反向，5'-TGCTGACTTCAGGAGAAGGGT-3'；和β-actin，正向，5'-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'；反 向，5'-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'。

1.4 Western blotting

取0.05 g的组织样品，采用RIPA裂解液裂解组织后，采用BCA法测定提取蛋白浓度。以30μg的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后电转至PVDF膜上。电转结束后，5%的脱脂牛奶室温封闭1 h后在4℃孵育DAB2或actin一抗过夜。过夜后，室温孵育二抗1 h后，TBST摇洗10 min，3次后，ECL方法进行曝光。

1.5 免疫组化（IHC）检测DAB2的表达

取新鲜组织，乙醇梯度脱水之后进行石蜡包埋。常规切片（5μm）、脱蜡、水化后，放入数控热抗原修复仪进行抗原修复。采用过氧化氢阻断内源性的过氧化物酶之后，4℃孵育DAB2或actin一抗过夜后，TBST洗涤后室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗0.5 h，采用DAB方法进行显色，苏木素染核。最后，进行梯度脱水和二甲苯透明后，采用中性树脂进行封片观察。

1.6 统计方法

该次研究采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（x±s）表示，行t检验；计数资料以[n(%)]表示，行χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-aPCR和Western blotting检测DAB2在肝癌中表达水平

收集肝癌患者的组织样本，提取RNA后采用RTαPCR检测患者癌和癌旁组织中DAB2的mRNA表达水平后发现，DAB2在肝癌癌旁组织中的表达水平显著高于癌组织(1.92±0.85)vs（1.27±0.81）,差异有统计学意义(t=15.330，P<0.001)，见图1。同时检测DAB2的蛋白表达水平后也发现，DAB2在肝癌癌旁组织中的表达水平显著高于癌组织，见图2A。进一步的定量分析结果发现，DAB2在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织（0.31±0.15)vs(0.79±0.20),差异有统计学意义(t=6.530，P<0.001)，见图2B。以上结果提示，DAB2在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织。

图2 肝癌和癌旁组织中DAB2的蛋白表达水平Figure 2 DAB2 protein expression levels in liver cancer and adjacent tissues

2.2 IHC检测DAB2在肝癌组织中的表达

为了进一步确认DAB2在肝癌组织中的表达情况，该研究还采用IHC方法对组织中DAB2的表达水平进行了检测。研究发现，DAB2在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织，见图3，提示DAB2在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织。

图3 IHC检测DAB2在肝癌和癌旁组织中的表达Figure 3 IHC detection of DAB2 expression in liver cancer and adjacent tissues

2.3 DAB2表达与肝癌临床表征关系

由上文的研究可发现，DAB2在肝癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织。因此，该研究根据肝癌组织中DAB2表达是否低于癌旁组织，将纳入的51例肝癌患者分为DAB2的高表达组（n=15）和DAB2的低表达组（n=36），然后分析比较DAB2表达与肝癌患者临床表征的关系。结果发现，两组患者的性别、年龄（55.13±16.64）岁vs（55.50±11.00）岁，差异无统计学意义(t=0.094，P=0.926)、肿瘤体积、淋巴结转移方面差异无统计学意义（P＞0.05）。但是肿瘤组织中低表达患者的肿瘤分期和血管侵袭发生率显著高于高表达的患者，差异有统计学意义（P<0.001），而高分化程度及未发生远端转移则显著低于高表达的患者，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 DAB2表达与肝癌患者临床表征关系[n(%)]Table 1 The relationship between DAB2 expression and clinical manifestations of liver cancer patients[n(%)]

3 讨论

HCC是目前世界范围内发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一，手术切除和肝移植目前是HCC根治性的治疗手段。但由于HCC发病隐匿、进展迅速，多数的患者在确诊时已经发展到HCC的中后期，仍存在部分患者无法进行根治性手术的治疗[5]。因此，深入研究HCC的发病机制，寻找新的、有效的HCC的控制手段对于提高HCC患者的诊疗效果尤为重要。近年来，有大量的研究报道HCC的发病机制，但是HCC的发病机理仍未完全阐述清楚。

DAB2是人5号染色体编码的长度约为3.6 kb的mRNA。DAB2蛋白主要通过3个功能区域进行分子活动的调控：N段的磷酸酪氨酸结合区或磷酸作用区和C-端的脯氨酸区域[6]。其中N段的磷酸酪氨酸结合区域和磷酸作用区域是转录因子受体TGF-β信号通路所必需，因此研究DAB2在肿瘤中的调控机制对于有效控制TGF-β信号通路异常的癌症的发展过程具有重要意义。早期研究表明，DAB2蛋白表达水平在95%的非小细胞肺癌组织中显著降低；相较于癌旁组织，DAB2 mRNA在非小细胞肺癌中的表达下降达到60%左右[7]。与健康组织相比，DAB2在食管鳞状细胞癌中的表达也显著降低，沉默DAB2的表达能够显著促进食管鳞状细胞癌细胞的增殖和转移[8]。前列腺癌组织中DAB2的表达也显著低于癌旁组织，下降约80%左右，miRNA-93能够通过靶向下调DAB2促进前列腺癌发展过程[9]。该研究中采用RT-qPCR技术检测肝癌及癌旁组织样本发现，DAB2 mRNA表达水平在肝癌组织中的表达水平相较于癌旁组织下降60%左右，western blot检测结果也发现DAB2在肝癌组织中表达均显著低于癌旁组织，以上研究结果与前人研究结果一致。有学者应用免疫组化检测发现DAB2在乳腺癌组织中异常低表达，其中76%(58/76)乳腺癌样本中基本检测不到DAB2的表达，DAB2表达缺失能够显著削弱其对TGF-β的抑制作用而促进Treg细胞的发展[10]。Yuan C等人[11]的研究也发现miR-106b能够通过靶向TGF-β信号通路中DAB2促进宫颈癌细胞的迁移。该研究中同样采用免疫组化手段对HCC癌组织和癌旁组织中的DAB2的表达进行检测发现，DAB2在癌组织中的表达显著低于癌旁组织。以上的研究表明，DAB2可能通过TGF-β信号通路在肝癌的发生过程中发挥重要的抑癌作用。

近年来的临床研究显示，DAB2与多种肿瘤患者临床病理特征密切相关。Wang等人[12]在食管癌的研究中发现低表达的DAB2能够促进肿瘤的进展、肿瘤的复发，导致不良预后。非小细胞肺癌的研究中也发现，低表达的DAB2与非小细胞肺癌早期复发、转移、耐药性及不良预后呈显著正相关关系[13-14]。结合患者的临床信息，该研究对DAB2表达与患者的临床病理特征进行分析，发现低表达DAB2与患者的肿瘤分期、血管侵袭及分化程度有显著关系，与前人研究结论一致。近期Sun等人[15]的研究发现，miR-106在肝癌组织中显著高表达，其能够通过靶向下调DAB2表达促进肝癌下部的增殖和转移。以上的研究结果提示，DAB2能够通过抑制肝癌细胞的增殖及转移抑制肝癌的发生发展过程，但是具体的调控机制仍待进一步的挖掘。

综上所述，DAB2的表达在HCC中显著下调，且与患者的肿瘤分期、血管侵袭和分化程度密切相关，提示DAB2在HCC的发生发展过程中发挥重要的调控作用。因此，深入研究DAB2在HCC的调控机制，对于提高HCC的诊疗效果具有重要意义。