柚皮素增加自噬抑制泡沫细胞的形成

陈雨露，杜延飞，郑文武，李 光，郑舒展*

1西南医科大学附属医院 心血管内科；2西南医科大学心血管研究所，泸州 646000

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性动脉疾病，影响动脉内中外三层膜的功能，它的特征是动脉壁上的内膜斑块的增厚和胆固醇的堆积[1]。动脉粥样硬化所致的心血管疾病在西方国家中占有很高的致死率[2]。泡沫细胞的形成在动脉粥样硬化的发生发展中起到了关键性作用，是动脉粥样硬化斑块内出现的特征性病理细胞[3]，主要是由单核细胞分化的巨噬细胞吞噬大量氧化修饰的低密度脂蛋白形成，其分泌多种炎症因子及基质代谢酶可诱导血管平滑肌细胞凋亡，破坏纤维的胶原成分，导致粥样斑块不稳定和急性心血管事件的发生[4,5]。自噬是细胞器及蛋白质聚集体等细胞质组分通过溶酶体装置分解和回收的机制。自噬维持细胞代谢平衡及内环境稳定，是一种细胞修复过程，自噬功能的缺陷可促进动脉粥样硬化的发生[6,7]。柚皮素是天然的黄酮类化合物，对动脉粥样硬化具有保护作用[8]，其作用机制有待进一步明确。本研究观察柚皮素对泡沫细胞形成的影响以及探讨是否通过自噬途径发挥作用，为其防治动脉粥样硬化的临床应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养

细胞株THP-1(human acute monocytic leukemia cell line，THP-1)(武汉普诺赛生命科技有限公司)；RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司)；青链霉素(中国碧云天公司)。

1.1.2 试剂

柚皮素(naringenin)(中国思域化工)；PMA、3MA(美国Sigma公司)；氧化低密度脂蛋白ox-LDL(广州奕源生物科技有限公司)；cck-8试剂盒(中国碧云天公司)；雷帕霉素(rapamycin，Rapa)(美国MedChemExpress公司)；compound C、饱和油红O染色液(中国索莱宝公司)；LC3、SQSTM1/p62、AMPK、p-AMPK抗体(美国CST公司)；HRP标记的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗(上海斯信生物科技有限公司)。

1.1.3 仪器

Heracell 150i CO2恒温培养箱(美国Thermo scientific公司)；Infinite M200全自动酶标仪(瑞士TECAN公司)；IX71-F22PH倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；SW-CJ-2G型超净工作台(苏州净化公司)；低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Sim-140制冰机(日本SANYO公司)；BS224S电子天平(德国Sartorius公司)。

1.2 方法

1.2.1 泡沫细胞模型的构建及分组

使用含10% FBS和1%青链霉素的RPMI-1640培养基培养THP-1细胞于CO2浓度为5%的培养箱中，在37 ℃条件下培养至对数生长期，然后用160 nmol/L PMA的无血清培养基诱导48 h，使其成为THP-1源性的巨噬细胞。再将得到的巨噬细胞用50 μg/mL ox-LDL 3%FBS培养基培养72 h成为泡沫细胞。本实验共分为3个组，第1组为：空白对照组(不加入任何干预药物)，模型组(加入50 μg/mL ox-LDL)，不同浓度的柚皮素组(50 μg/mL ox-LDL+10、25、50、100 μmol/L柚皮素)；第2组为：空白对照组，模型组，柚皮素组(50 μg/mL ox-LDL+100 μmol/L柚皮素)，雷帕霉素组(50 μg/mL ox-LDL+100 nmol/L雷帕霉素)，3MA组(50 μg/mL ox-LDL+5 mmol/L 3MA)；第3组为：为空白对照组，模型组，柚皮素组，compound C组(50 μg/mL ox-LDL +10 μmol/L AMPK拮抗剂compound C)，柚皮素与compound C共处理组(50 μg/mL ox-LDL +10 μmol/L compound C+100 μmol/L柚皮素)。

1.2.2 细胞活性检测

将正处于对数生长期的THP-1细胞与160 nmol/L PMA的无血清培养基配制成浓度为1×105个/mL的细胞悬液，再按照每孔104个细胞接种于96孔板，安置于培养箱中培养48 h，再按照CCK-8试剂盒说明书操作，加入不同浓度的柚皮素(0、5、10、25、50、100 μmol/L)，用酶标仪测定490 nm波长下的光吸收值。

1.2.3 油红O染色

用上述方法将THP-1细胞源性巨噬细胞配置成浓度为5×105个/mL的细胞悬液，按照每个孔106个细胞均匀接种于6孔板中，分为2组，按照上述空白对照组及模型组处理后，用PBS漂洗3次，再用4%多聚甲醛在37 ℃固定15 min，用PBS漂洗2次，油红O染色25 min，60%异丙醇漂洗5 s，再用PBS漂洗3次。显微镜下观察，按文献所述：胞内较大红染颗粒≥5个即可判定为泡沫细胞[9]。

1.2.4 Western blot(蛋白质免疫印迹法)

收集上述分组处理好的细胞，加入细胞裂解液提取总蛋白，并采用BCA法测蛋白浓度。分别使用10%、12%分离胶进行凝胶电泳(SDS-PAGE)，每孔上样量为20 μg，按照浓缩胶70 V，分离胶110 V进行恒压电泳，切取需要的胶带，400 mA恒流转至PVDF膜上，使用5%脱脂牛奶封闭1 h，将一抗按1∶1 000比例稀释后于4 ℃孵育过夜，次日用TBST漂洗3次，每次10 min，后用HRP标记的羊抗兔或者羊抗鼠二抗(1∶2 000)于室温孵育2 h，再加TBST摇床洗膜3次，每次10 min，使用化学发光法显影，拍照保存进行分析，使用Quantity One图像分析软件分析条带，分析目的蛋白的表达水平。

1.2.5 细胞内总胆固醇含量的测定

将收集的细胞制成悬液后用1 000 rpm离心10 min，去掉上清液，收集细胞样本后使用超声波破碎细胞以获得匀浆液，再按照总胆固醇测定试剂盒说明书测定细胞内总胆固醇含量(TC)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 泡沫细胞模型的建立

油红O染色结果如图1。结果表明：空白对照组与模型组相比较，模型组细胞内有大量红染脂滴颗粒，且胞内较大红染颗粒≥5个，细胞模型成功建立。

图1 泡沫细胞模型的建立(油红O染色，×400)Fig.1 Establishment of foam cell model (oil red O staining,×400)注：A：空白对照组；B：模型组(ox-LDL 50 μmol/L)。Note:A:Control group;B:Model group (ox-LDL 50 μmol/L).

2.2 不同浓度的柚皮素对细胞的毒性影响

使用CCK-8试剂盒测定不同浓度的柚皮素对细胞的活性影响以排除其毒性影响。结果见图2，细胞活力=[ (加药细胞OD-空白OD)/ (对照细胞OD-空白OD) ] ×100%，结果表明，当柚皮素浓度大于等于5 μmol/L时，柚皮素对细胞活性无毒性影响，差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 柚皮素对细胞活性的影响Fig.2 Effect of naringenin on cell activity注：与空白对照组相比，P>0.05。Note:Compared with control,P>0.05.

2.3 柚皮素对泡沫细胞自噬相关蛋白表达的影响

2.3.1 不同浓度的柚皮素对泡沫细胞自噬的影响

如图3所示，与空白对照组相比，模型组LC3II/LC3I比值降低，p62升高(P<0.05)；随着柚皮素浓度的增加，25 μmol/L以上浓度的柚皮素增加泡沫细胞的自噬水平，主要表现为LC3II/LC3I比值增加，P62蛋白水平降低，在100 μmol/L时作用最明显(P<0.05)，故选择100 μmol/L的柚皮素为使用浓度。

2.3.2 不同浓度柚皮素对泡沫细胞总胆固醇含量的影响

如图4所示，与空白对照组相比，模型组的细胞内总胆固醇含量高(P<0.05)，随着柚皮素浓度增加，泡沫细胞内胆固醇含量逐渐降低，在柚皮素浓度为100 μmol/L时最低(P<0.05)。

2.3.3 柚皮素对泡沫细胞自噬的影响

如图5所示，与空白对照组相比，模型组的LC3II/LC3I的比值降低，P62蛋白的表达水平升高(P<0.05)，自噬水平降低；与模型组相比较，柚皮素组与Rapa组的LC3II/LC3I的比值都增加，3MA组比模型组的LC3II/LC3I的比值降低(P<0.05)；柚皮素组与Rapa组相比，LC3II/LC3I的比值更高，并且P62表达水平较模型组降低(P<0.05)。

2.4 柚皮素对泡沫细胞自噬影响的机制探讨

如图6所示，实验结果表明，与空白对照组相比较，模型组p-AMPK/AMPK与LC3II/LC3I比值均降低，与模型组相比，柚皮素组p-AMPK/AMPK比值与LC3II/LC3I比值均升高(P<0.05)；compound C组与compound C+柚皮素共处理组结果一致，与模型组相比p-AMPK/AMPK与LC3II/LC3I比值均降低(P<0.05)。

图3 不同浓度的柚皮素对泡沫细胞自噬的影响Fig.3 Effects of different concentrations of naringenin on autophagy of foam cells注：与空白对照组相比，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05.

图4 不同浓度柚皮素对泡沫细胞胆固醇含量的影响Fig.4 Effects of different concentrations of naringenin on cholesterol content in foam cells注：与空白对照组相比，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05.

2.5 柚皮素对泡沫细胞胆固醇含量的影响

如图7所示，模型组比空白对照组的总胆固醇含量增多，而柚皮素组比模型组显著减少(P<0.05)； compound C组与compound C+柚皮素共处理组结果一致，均为与模型组相比，总胆固醇含量增多(P<0.05)。

3 讨论

动脉粥样硬化是在动脉硬化的血管病中最常见的一种，是由多种病因，多种因素作用于不同环节产生，在心血管疾病中，有着很高的死亡率[10]。动脉粥样硬化的发病机制尚未完全确定，但巨噬细胞相关胆固醇代谢异常是主要原因之一，动脉内膜受损，巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白形成泡沫细胞是动脉粥样硬化的起点[11]。

自噬是一种保守的分解代谢过程，在多种疾病的多种细胞过程中发挥重要作用，可将细胞内的蛋白质和细胞器传递到溶酶体进行降解和循环[12]，对维持细胞内环境的稳定至关重要。过度的自噬已被证明是致病的，许多研究报道了自噬在冠心病中发生的意义，自噬可能在冠心病患者血清白蛋白降低的相关心血管事件中发挥作用；自噬对冠心病患者的巨噬细胞内低密度脂蛋白的降解有保护作用[13-15]。但自噬在动脉粥样硬化中的具体作用机制尚不明确。研究表明，自噬延缓了动脉粥样硬化的进程，但是有缺陷的自噬加快了动脉粥样硬化的进程[16,17]。

柚皮素是天然的黄酮类化合物，主要存在于葡

图5 柚皮素促进泡沫细胞自噬Fig.5 Naringenin promotes autophagy of foam cells注：与空白对照组相比，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与Rapa组比较，▲P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05;Compared with Rapa,▲P<0.05.

图6 柚皮素对泡沫细胞自噬影响的机制探讨Fig.6 Mechanism of effect of naringenin on autophagy of foam cells注：与空白对照组相比，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。Note:Compared with control,*P<0.05;Compared with model,#P<0.05.

萄柚和橙子中，它的结构与广泛研究的多酚白藜芦醇相似，具有潜在的健康益处[18]，有研究表明，柚皮素具有抗动脉粥样硬化作用[19]，柚皮素可以增加THP-1源性巨噬细胞的胆固醇外排[20]。但柚皮素防治动脉粥样硬化的具体机制仍需进一步研究，鉴于黄酮类化合物可能有促进自噬活性的作用[21,22]，我们推测，柚皮素可能通过增加自噬来减轻粥样硬化斑块病变，从而对动脉粥样硬化起保护作用。本研究结果表明，泡沫细胞的形成伴有自噬能力的受损，表现为LC3II/LC3I比值降低，P62水平升高。25 μM以上浓度的柚皮素呈浓度依赖性的增加巨噬细胞自噬流水平，在100 μM作用最强。与自噬增强剂雷帕霉素相比，柚皮素升高LC3II的作用更明显。同时25 μM以上浓度的柚皮素浓度依耐性地降低巨噬细胞内总胆固醇的含量，抑制泡沫细胞的形成。

图7 柚皮素对泡沫细胞胆固醇含量的影响Fig.7 Effect of naringenin on cholesterol content of foam cells注：与空白对照组相比，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05。Note:Compared with control, *P<0.05;Compared with model, #P<0.05.

为进一步探讨柚皮素促进巨噬细胞自噬的机制，我们选择自噬通路的调节因子AMPK作为观察指标。AMPK是细胞能量代谢的传感器，调节细胞代谢以维持能量稳态，包括脂质代谢，并通过ULK-1激活自噬，并且促进自噬[23]。Wu等[24]研究发现丹皮酚通过上调自噬和激活AMPK磷酸化来达到抗动脉粥样硬化的作用，还有相关文献报道，黄连素可以通过激活AMPK/mTOR信号通路诱导的自噬来预防动脉粥样硬化[25]，而且morin可通过激活HUVECs中的AMPK信号通路，诱导自噬，从而减轻ox-LDL介导的损伤[26]。本研究结果显示，AMPK抑制剂compound C可降低磷酸化AMPK的水平，降低LC3II/LC3I的比值；增加泡沫细胞内胆固醇的含量。说明AMPK可能通过影响自噬参与巨噬细胞内胆固醇含量的调节。而柚皮素能够增加泡沫细胞内磷酸化AMPK的水平，促进自噬。另外，将柚皮素处理的泡沫细胞预防性加入AMPK抑制剂compound C，compound C抑制了柚皮素对泡沫细胞的降胆固醇作用。说明柚皮素通过增加AMPK磷酸化而促进自噬。

综上，柚皮素的抗动脉粥样硬化作用可能与其增加泡沫细胞的自噬有关，柚皮素可通过增加AMPK磷酸化水平促进自噬，进而抑制动脉粥样硬化中泡沫细胞的形成，延缓动脉粥样硬化的发生与发展。