苗药“杆努尽烟”对慢性支气管炎大鼠TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的影响*

吴宁， 黄雨霄， 石雪， 陈晋伦， 彭凌峰， 杨露露， 徐红， 孙见飞， 刘华

(贵州医科大学 基础医学院 基础医学实验教学中心， 贵州 贵阳 550025)

慢性支气管炎(chronic bronchitis，CB)是一种临床常见的呼吸系统疾病，主要临床表现为咳嗽、咳痰或伴有喘息，常并发阻塞性肺气肿[1]。CB病程晚期，可进展为肺动脉高压、肺源性心脏病[1-2]。临床常采用西药对CB进行治疗，且具有起效快、疗效明显等优势，但CB病程长且容易复发，因需长期服药，患者的依从性较差，而传统中草药具有多成分、多靶点、多途径及副作用小等特点，在CB的治疗方面具有一定的潜力[3-4]。贵州凯里苗族地区常采用特色药方“杆努尽烟”对支气管炎进行治疗，疗效显著[5-6]；但因其作用机制尚不明确，从而阻碍了该药的研发，该药一直处于经验用药阶段。根据课题组前期研究结果[7]，本研究采用低(2 g/kg)、高(8 g/kg)两个剂量的“杆努尽烟”对CB模型大鼠进行治疗，并于用药的第28天时观察大鼠肺组织的病理变化、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量及Toll样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)-髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)-核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路中TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达水平，探究苗药“杆努尽烟”对CB大鼠模型的疗效及其可能机制，为该药的开发利用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 30只清洁(specific pathogen free，SPF)级、7～8周龄SD(sprague dawley，SD)大鼠，雌、雄各半；体质量(200±20)g，由重庆腾鑫公司提供[SYXF(黔)2018-0001]。

1.1.2药物 苗药“杆努尽烟”全草采摘于凯里市炉山镇，经贵州省中医药大学潘炉台教授鉴定属吊石苣苔属植物吊石苣苔(LysionotuspauciflorusMaxim.)；桂龙咳喘宁胶囊购自桂龙药业有限责任公司。

1.1.3主要试剂 脂多糖(美国Sigma)，TNF-α酶联免疫试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，批号A38281155)，TLR4兔抗大鼠一抗(美国Abcam公司)，MyD88兔抗大鼠一抗(美国CST公司)，NF-κB p65兔抗大鼠一抗(中国武汉Abclonal公司)，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔，免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)二抗(中国武汉Abclonal公司，批号AS014)，内参蛋白β-actin兔抗大鼠一抗(中国武汉Abclonal公司)，实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，Real-time PCR)反应试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κBp65 mRNA及内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADPH)引物(武汉天一辉远公司)，贵烟黄果树蓝佳品(贵阳卷烟厂)。

1.1.4主要仪器 4 ℃高速低温离心机(美国Thermo公司)，RM2015型石蜡切片机(德国Leica公司)，BX51T-PHD-J11 型显微镜(日本Olympus公司)，Synergy H1全功能酶标仪(美国 Bio Tek公司)，上海嘉腾凝胶成像系统(上海嘉腾科技有限公司)，ABI StepOnePlusTMReal-time PCR(美国Thermo)。

1.2 方法

1.2.1苗药“杆努尽烟”水提液的制备 取2 000 g“杆努尽烟”全草，浸泡于蒸馏水中1 h，电热恒温水浴箱90 ℃ 连续浸提全草12 h，收集、过滤、旋蒸水提液，浓缩至2.5 kg/L。最后高压蒸汽灭菌分装，4 ℃贮存。

1.2.2大鼠分组及CB模型建立 制备大鼠吸烟室(0.55 m×0.45 m×0.35 m，上壁留有通气孔)。30只大鼠在无烟环境中喂养7 d，随机分为CB模型组、正常对照组、阳性药物组、低剂量“杆努尽烟”组及高剂量“杆努尽烟”组，每组6只。正常对照组进行无烟处理；其余4组大鼠进行烟熏处理，30 min/次、2次/d，其中造模的第1天和第14天不做烟熏处理，采用8%水合氯醛(3 mL/kg)行腹腔注射，然后将200 g/L脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)溶液200 μ L注射入气管内，建立CB大鼠模型，共计28 d[8-9]；造模结束后，5组大鼠进行灌胃给药处理，低剂量“杆努尽烟”组、高剂量“杆努尽烟”组分别按2 g/kg、8 g/kg灌胃，阳性组为1 g/kg桂龙咳喘宁灌胃，正常对照组和CB模型组，用等量生理盐水(normal saline，NS)进行灌胃，1次/d，持续给药28 d[7,10]。

1.2.3呼吸系统症状观察及肺组织的收集 造模成功及灌胃给药第28 天时，比较5组大鼠大鼠呼吸系统症状。于灌胃给药处理第28 天时，麻醉状态下心脏取血法处死大鼠，取出大鼠肺组织，部分制作HE切片、部分直接使用，下余部分用RNA保存液处理后保存于-80 ℃冰箱、用于后续指标的检测。

1.2.4大鼠肺切片组织学变化 取新鲜肺组织，用0.9%NaCl溶液冲洗，用4%甲醛固定左肺上叶，制作切片并苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，光镜下观察肺组织改变。

1.2.5肺组织中TNF-α含量 采用酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测，取50 mg新鲜肺组织，快速剪碎，加入PBS，充分研磨，在5 000 r/min，4 ℃的条件下，离心10 min，取上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测TNF-α表达水平。

1.2.6肺组织TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表达 采用Real-time PCR法检测，Trizol法提取总RNA，取1 μg RNA进行逆转录反应，合成cDNA。TLR4、MyD88、NF-κBp65及内参照GADPH引物序列见表1。按Real-time PCR步骤：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，共40个循环。反应完成后，读取各样本扩增循环数(cycle Threshold，Ct)值，用相对定量法计算各指标mRNA的相对表达水平。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of PCR

1.2.7TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表达 采用蛋白免疫印迹法(Western blot)法测定，取新鲜肺组织60 mg，置于研钵中，快速剪碎，加裂解液600 μL充分研磨，总蛋白浓度用聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)法测定。取总蛋白40 μg，置于95 ℃恒温水浴箱8 min，随后上样。经SDS-PAGE电泳、转膜后，用5%(tris buffered saline tween，TBST)脱脂奶粉封闭1 h，加入兔抗大鼠一抗，4 ℃孵育过夜。洗涤聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜3次，5 min/次，加HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，孵育120 min。用电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)混合液显色、凝胶成像系统进行数据分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 呼吸系统症状

造模成功后，正常对照组大鼠饮食饮水活动正常，无明显咳嗽、喘息等症状；与正常对照组比较，其余4组大鼠体质量减轻，并伴有咳嗽、喘息等症状；灌胃给药第28天时，与CB模型组大鼠比较，阳性药物组、低剂量“杆努尽烟”组及高剂量“杆努尽烟”组大鼠的呼吸系统症状均有改善，其中高剂量组大鼠效果最为明显。

2.2 大鼠肺组织学改变

灌胃给药第28 天时，正常对照组肺泡壁、细支气管上皮细胞结构完整，无炎症损伤；CB模型组可见肺泡壁缺损，细支气管上皮排列紊乱，炎性细胞明显聚集，管壁上皮坏死、脱落，提示造模成功；与CB模型组比较，阳性药物组、低剂量“杆努尽烟”组、高剂量“杆努尽烟”组肺泡壁及细支气管损伤程度明显减轻，炎性细胞明显减少，上皮排列较完整，但管腔内仍可见明显炎症损伤及少量脱落物。见图1。

图1 各组大鼠肺组织形态学(HE，×400)Fig.1 Effect of L. pauciflorus Maxim. on histopathological morphology of rat lung tissue(HE，×400)

2.3 大鼠肺组织中TNF-α表达

灌胃给药第28 天时，与正常对照组比较，其余4组大鼠肺组织中TNF-α含量均有增加(P<0.05)；与CB模型组比较，各给药组经药物干预后，肺组织TNF-α含量均有不同程度的减少(P<0.05)，其中高剂量“杆努尽烟”组减少大于低剂量“杆努尽烟”组，但差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

注：(1)与正常对照组比较，P<0.05；(2)与CB模型组比较，P<0.05。图2 各组大鼠肺组织中TNF-α表达Fig.2 Expression of TNF-α in lung of rats

2.4 大鼠肺组织中TLR4、MyD88及NF-κB p65 mRNA的表达

灌胃给药第28 天时，与正常对照组比较，其余4组大鼠肺组织中TLR4、MyD88及NF-κBp65 mRNA表达水平增加(P<0.05)，其中CB模型组增加最明显；与CB模型组比较，各给药组大鼠经药物干预后，肺组织中TLR4、MyD88、NF-κBp65 mRNA表达均有不同程度的降低(P<0.05)，其中高剂量“杆努尽烟”组降低最明显。见图3。

注：(1)与正常对照组比较，P<0.05；(2)与CB模型组比较，P<0.05。图3 各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88及NF-κB p65 mRNA表达Fig.3 Expression of TLR4，MyD88，and NF-κB p65 mRNA in lung tissue of rats

2.5 大鼠肺组织中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表达

灌胃给药第28 天时，与正常对照组比较，其余4组大鼠肺组织中TLR4、MyD88及NF-κB p65 表达水平增加(P<0.05)，其中以CB模型组最为明显；与CB模型组比较，各给药组大鼠经药物干预后，肺组织中TLR4、MyD88及NF-κB p65蛋白表达水平均有不同程度的降低(P<0.05)，其中高剂量“杆努尽烟”组降低最明显。见图4。

注：(1)与正常对照组比较，P<0.05；(2)与CB模型组比较，P<0.05。图4 各组大鼠肺组织中TLR4、MyD88及NF-κB p65 蛋白表达Fig.4 Expression of TLR4，MyD88，and NF-κB p65 protein in lung tissue of rats

3 讨论

CB是指发生于气管、支气管黏膜及其周围组织的慢性非特异性炎症，每年发病持续3个月或更长，有的可连续2年。CB的病因和发病机制尚不完全清楚，吸烟、革兰阴性菌感染是最重要的环境发病因素，空气污染、职业粉尘与慢性气道炎症的发生发展也有着密切的联系[11-14]。资料表明，CB镜下特点主要表现为支气管上皮细胞变性、坏死、脱落，各级气管周围组织可见大量炎性细胞浸润。随着炎症损伤进一步加重，可引起肺泡腔扩大及肺泡弹性纤维断裂[15-16]。

苦苣苔科植物吊石苣苔，苗族名为“杆努尽烟”，主要成分中包含黄酮类物质，该成分在抗炎、抗感染方面有一定的疗效[17-18]。本研究结果显示，灌胃给药第28天时，经“杆努尽烟”干预的CB模型大鼠，其体质量、饮水饮食得到改善；咳嗽、喘息减轻；镜下可见大鼠肺泡壁及细支气管的炎症损伤明显减轻。据此推测“杆努尽烟”对CB有较强的抗炎作用，从而缓解CB的临床症状。

多项研究显示，TLR4-MyD88-NF-κB信号通路是慢性支气管炎发病的重要机制之一[19-20]。TLR4是一种重要的免疫识别受体，连接天然免疫和获得性免疫，在启动和调节气道炎症过程中发挥重要作用[21]。香烟烟雾和LPS可以激活TLR4，激活的TLR4会将信号向细胞内传导，从而使MyD88被特异性激活，将信号进一步传到至NF-κB，NF-κB进入到细胞核内与特定的靶基因结合，促进TNF-α等炎症介质大量释放[22-23]，最终导致肺泡、细支气管等结构受到炎症破坏[24-25]。灌胃给药第28天时，本研究检测了各组大鼠肺组织中TNF-α的含量及TLR4、MyD88、NF-κB p65 mRNA及蛋白表达水平，结果表明，经“杆努尽烟”干预的大鼠上述因子表达水平均明显下调。据此推测“杆努尽烟”可能是通过下调TLR4的表达水平进而抑制MyD88和NF-κB的磷酸化，减少下游炎症因子TNF-α等的释放，从而减轻大鼠肺部炎症损伤。

综上所述，炎症反应是CB发生发展的核心机制，贵州苗药“杆努尽烟”可通过其较强的抗炎作用，减轻CB的炎症损伤，进而缓解其临床症状，而 TLR4/MyD88/NF-κB通路可能是其发挥抗炎作用的、潜在的重要靶点之一，这为今后深入探究”杆努尽烟”治疗CB的作用机制提供科学依据。