钙激活氯通道蛋白ANO1在心肌成纤维细胞分化过程中的表达及其钙激活氯通道电生理特性变化*

田香勤，谭朝阳，李娜娜，常玉巧，张爱梅，周 颖，马克涛，司军强Δ

(1.石河子大学医学院生理教研室，新疆 石河子 832000；2.新乡医学院河南省高等学校组织再生重点开放实验室，河南 新乡 453003；3.中国人民解放军克拉玛依军分区，新疆 克拉玛依 834000；4.石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子 832000)

自从2008年三个实验室分别在Nature，Science和Cell杂志报道证实，ANO1(anoctamin-1，亦称TMEM16A, DOG1, ORAOV2或TAOS2)是钙激活氯通道(calcium-activated chloride channels, CaCCs)的分子基础以来[1-3]，ANO1成为目前离子通道研究的热点。ANO1蛋白包含10个跨膜结构域，表现为CaCCs生理和药理学功能，对阴离子选择性顺序为NO3->I->Br->Cl->F-，与报道的内源性CaCCs具有相似的阴离子选择特性[1]。ANO1在胰腺腺泡细胞、视网膜细胞层、近端肾小管、背根神经节感觉神经元、颌下腺感觉神经元、气管上皮、血管平滑肌、心脏、部分肿瘤等均有表达[4]。作为anoctamin氯离子通道家族中的成员，ANO1蛋白参与跨上皮细胞离子转运、平滑肌收缩、嗅觉产生、光感受、伤害性感受和神经元兴奋性的调节，以及上皮分泌、细胞的增殖迁移、气道粘液分泌、唾液分泌、消化道慢波电位形成和血管紧张性调节等病理生理过程[5]。

心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)约占心肌总细胞数的60%～70%，它是细胞外基质组分的重要来源[6]。CFs在健康心脏中多以静止形式存在，但在炎症、创伤等因素作用下分化为成肌纤维细胞(myofibroblasts，MFs)，其典型特征是α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达增高，细胞的增殖、分泌和迁移能力增强[6,7]。同时细胞内离子浓度发生改变，特别是氯离子浓度的改变对细胞体积和细胞周期产生影响[8]。有报道CFs中存在ANO1的表达，并且CFs中的钙激活氯通道电流(Ca2+-activated Cl-current,ICl(Ca))在AngII刺激作用下明显增强[9]。但ANO1在CFs分化为MFs过程中的表达变化及其作用机制尚不清楚。心肌成纤维细胞的体外培养区别于体内稳定环境，培养48 h的CFs已经达到对数生长期，其中大多数细胞已经分化为MFs，其增殖、迁移和胶原分泌能力增强[10]。本研究以刚贴壁培养的SD乳鼠原代CFs和传至第三代已分化为MFs的细胞为研究对象，利用全细胞膜片钳、形态学和分子生物学等技术探索ANO1在CFs分化为MFs过程中的表达规律及电生理特征，进一步拓展对ANO1功能的认识。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

低糖培养基(货号：SH30021.01)购自HyClone公司；胎牛血清(货号：1600-044)购自Gibico公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号：P0012S)购自Beyotime公司；小鼠Anti-α-SMA抗体(货号：BM0002)购自武汉博士德生物公司；青链霉素溶液(货号：C0222)、羊抗兔CY3抗体(货号：A0516)和FITC标记羊抗小鼠IgG(货号：A0568)购自Beyotime公司；胰酶(含酚红，EDTA)(货号：T1320)购自Solarbio生物公司；Anti-TMEM16A抗体(货号：ab53213)购自abcam公司；NaATP(货号：A2383)、CaCCinh-A01(货号：SML0916)和T16Ainh-A01(货号：SML0493)均购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 原代心肌成纤维细胞分离培养方法

无菌条件下取新生SD大鼠心脏(实验动物来源于新乡医学院实验动物中心，动物合格证号：SYXK(豫)2009-0002)，用预冷的低糖DMEM培养基冲洗5次，除去心房组织和心脏内血液，用眼科剪将心脏剪成约1 mm3小块，加入0.1%的Ⅱ型胶原酶和0.125%胰蛋白酶(二者体积比为3∶2)，放置于37℃培养箱，每4 min吹打一次，吸取上清放入加有10%胎牛血清培养基，中和消化酶活性，剩余组织块加入联合酶继续消化至组织块完全消化松软，加入5 ml培养基吹打使细胞脱落，收集所有消化后的细胞，采用200 μm孔的滤器过滤，1 000 r/min 离心5 min，用完全培养基悬浮沉淀细胞并接种，45 min后，弃上清，贴壁细胞用于后续实验。

1.3 心肌成纤维细胞荧光标记方法

培养细胞于48孔板，4%多聚甲醛溶液室温固定20 min，加入0.3%的Triton透膜20 min，10%山羊血清封闭，室温孵育30 min，吸弃山羊血清直接滴加一抗，放于湿盒中4℃孵育过夜，第2日复温20 min，浸洗后滴加1∶500的FITC标记山羊抗小鼠或Cy3标记山羊抗兔二抗，室温孵育1～1.5 h，DAPI复染细胞核7 min，阴性对照为PBS代替一抗，各步骤间均用PBS洗3次，每次5 min。采用激光共聚焦显微镜观察并采集图片。其中纤维细胞鉴定用vimentin(1∶500兔抗大鼠抗体)抗体单标记，双标记采用ANO1一抗(1∶1兔抗大鼠ANO1抗体)和α-SMA一抗(1∶50小鼠抗大鼠α-SMA抗体)进行，孵育后同时加入相应的二抗。

1.4 全细胞膜片钳检测钙激活氯通道电流

采用差速贴壁分离心肌成纤维细胞，无菌状态下置于培养箱45 min备用，传代细胞用胰酶消化，静置贴壁后使用。采用P-2000电极拉制仪将带芯硼硅酸盐玻璃毛坯(Sutter Instrument公司生产)拉制成微电极。选取微电极的电阻值为2～8 MΩ，给予微电极内部一定负压，同时将钳制电位逐步调节至-70 mV，待细胞与电极间形成GΩ封接后，用嘴吸破膜法或同时辅助以电击破膜法破膜(膜片钳放大器提供的Zap功能)。破膜后，电阻值仍维持在GΩ以上的细胞用于膜片钳检测。

在电压钳模式下(钳制电压-70 mV)，记录膜电容(membrane capacity, Mc)，给予细胞一个斜坡刺激(-100 mV到100 mV，1000 ms)，用以测量并计算细胞的静息电位(resting potential, RP)；给予细胞步阶刺激(-100 mV到100 mV，步阶20 mV)，用以测量并计算电流密度(current density, CD)。记录的信号经MultiClamp 700B放大器放大，给予10 kHz的滤波，并由Axon Digidata 1550A数模/模数转换器转换，采样频率为10～20 kHz。

膜片钳用溶液配制：膜片钳用细胞外液(mmol/L)：NaCl 137，KCl 5.9，CaCl22.2，MgCl21.2，glucose 14，HEPES 10，用1 mol/L的NaOH调至pH值7.4左右，渗透压控制在320～330 mOsmol/kg；膜片钳用电极内液：CsCl 120 mmol/L，Tetraethylammonium-Cl 20 mmol/L MgCl22.8 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 5 mmol/L，(pCa 6.0)CaCl24.25 mmol/L，ATP Na22 mmol/L，用1 mol/L CsOH调节pH值为7.2，渗透压控制在320～330 mOsmol/kg[11]。

1.5 Western blot 检测蛋白表达

培养细胞用PBS清洗3遍后加入裂解液，六孔板加裂解液70 μl/well，反复吹打数次使细胞破碎，用细胞刮收集细胞破碎液于1.5 ml离心管，冰上放置10 min，充分裂解后离心提取蛋白。蛋白浓度测定后加入5×蛋白上样缓冲液以4∶1的比例混匀，95℃加热5 min使蛋白变性，冷却至室温后，分装放于-80℃备用。

配制8%分离胶和上层浓缩胶，采用稳压电泳，浓缩胶80 V，1 h后改为分离胶120 V至电泳结束。转膜采用0.2 A持续转1.5 h，用TBST洗膜10 min，5%脱脂奶粉孵育1 h，加入一抗4℃孵育过夜。次日复温30 min后用TBST溶液洗膜，摇床洗3次，每次10 min，二抗常温下孵育1.5 h，加入曝光试剂后利用Amersham Imager 600曝光成像系统采集图片，利用图像分析软件Image J 1.48v测定电泳条带的光密度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 CFs和MFs的鉴定

采用vimentin蛋白对心肌CFs纯度进行鉴定，荧光显微镜200倍下随机选取5个视野，对vimentin标记细胞和所有细胞核进行计数。结果显示，45 min差速贴壁的细胞多呈圆形，部分细胞伸出伪足贴壁，细胞纯度达到(93±2)%；CFs传至第3代时，细胞呈三角形或梭形，相比刚贴壁细胞体积较大，细胞纯度达到(96±3)%(图1A)。刚贴壁细胞大部分不表达α-SMA，传至第三代的细胞大部分强阳性表达α-SMA，表明已分化为MFs(图1B，图1见彩图页Ⅱ)。

2.2 钙激活氯通道电流特性

采用全细胞膜片钳记录心肌成纤维细胞ICl(Ca)，细胞钳制电位设置为-70 mV，当测试电位由-100 mV逐渐变化到+100 mV(步阶电压为20 mV)时，所得到的ICl(Ca)具有明显的外向整流特征，这一电流特征与经典的ICl(Ca)相符合；在+20 mv后，Icl(ca)随着刺激电压的增加而增大，向刚分离的心肌成纤维细胞中分别加入10 μmol/L的T16Ainh-A01和30 μmol/L的CaCCinh-A01后，全细胞膜片钳记录得到的ICl(Ca)幅度明显减小，给予外液冲洗细胞，电流恢复为原来的幅度，表明该实验条件下膜片钳检测为Icl(ca)(图2)。

Fig. 2 The effects of inhibitors on CaCCs currents in CFs

2.3 CFs和MFs钙激活氯通道电流差异

CFs和MFs的静息电位差异不明显，但新鲜组织分离的刚贴壁CFs细胞钙激活氯通道电流密度远高于MFs细胞，+40 mv至+100 mv电流密度组间差异显著(图3)。

Fig. 3 The detection of CaCCs currents in CFs of the early adherent and MFs

2.4 ANO1在CFs和MFs的表达特征

对刚分离贴壁的原代心肌CFs和MFs分别进行ANO1抗体和α-SMA抗体标记。结果显示，刚贴壁分离的心肌成纤维细胞呈椭圆形，细胞尚未完全伸展粘附于培养板，大部分细胞不表达α-SMA(FITC绿色荧光标记)，仅小部分有微弱表达，ANO1(Cy3红色荧光标记)在细胞核处呈较弱表达；MFs呈三角形或梭形，ANO1表达明显增强，主要表达于细胞核和近核膜的胞质区域，同时出现细胞膜少量表达，α-SMA呈线状分布于细胞质，其表达强度和ANO1趋势一致(图4A)。Western blot检测结果显示，刚贴壁培养的CFs中ANO1和α-SMA的表达(灰度值分别为0.436±0.009和0.106±0.007)均低于MFs(灰度值分别为0.753±0.036和0.979± 0.012)(P<0.01，图4B，图4见彩图页Ⅱ)。

3 讨论

膜片钳技术已成为研究离子通道功能的重要工具[12]。离子通道蛋白分子及其基因序列的确定为研究离子通道的功能奠定重要基础，进一步补充离子通道电生理研究[13]。Ca2+作为细胞内第二信使，调节众多的离子通道和信号通路，其中CaCCs是Ca2+依赖性的Cl-通道，受细胞内钙离子浓度调节[14]。在Ca2+浓度较低时，呈现外向整流特性，当存在高浓度Ca2+时却呈线性的电流-电压关系[15]。本试验中采用Ca2+浓度为4.25 mmol/L，电流表现为外向整流特征。另外，CaCCinh-A01和T16Ainh-A01是目前研究证实较为有效的CaCCs抑制剂，通常用于离子通道中CaCCs/ANO1的电生理检测[16]。本试验将以上两种抑制剂作用于新鲜分离培养的CFs，发现两者均能对CFs中的电流产生抑制，表明本试验所激发的电流为钙激活氯通道电流。

本研究发现，CFs在分离培养45 min左右即可牢固贴壁，在刚贴壁的CFs中α-SMA表达较弱，说明尚未活化为MFs。CFs在体外传代培养至第三代时，细胞内α-SMA的表达明显增强，表明CFs已经分化为MFs。Western blot和荧光标记结果显示，尽管MFs中ANO1蛋白含量较高，但其ICl(Ca)却出现减少的情况，从本实验结果推测其原因可能存在以下两个方面：首先，尽管细胞总体ANO1蛋白增加，但其主要表达于细胞核内、细胞核周的细胞质及细胞器中的蛋白明显增加，细胞膜表达变化不明显，在CFs分化过程中细胞膜上的ANO1蛋白亦可能存在不同的构象来调节离子通道的功能；其次，电流大小的改变与细胞功能密切相关，刚贴壁分离的CFs产生的ICl(Ca)较大，而MFs电流变小，ICl(Ca)具有外向整流的特征，CaCCs通道开放使得Cl-进入细胞内。细胞的去极化有利于细胞的增殖[17]，ICl(Ca)减弱使细胞去极化，从而促进CFs的增殖。

另外，ANO1在CFs中的表达分布特征也暗示ANO1不仅在细胞膜上发挥离子通道作用，在细胞核膜或细胞器膜也可能具有离子通道功能。目前许多离子通道的分子基础及功能尚未明确，从而导致对特定生理过程或疾病相关的通道类型产生分歧[18]。ANO1作为钙激活氯通道的分子基础，与细胞的增殖密切相关，其所发挥的作用可能不仅仅作为CaCCs通道的分子基础，也可能发挥调节因子的作用。已有研究证实ANO1在一些肿瘤细胞中呈高表达，并能够通过MAPK途径调节肿瘤细胞的分裂和生长[19]。氯离子是细胞功能的重要调节成分，在消化、肌肉活动、体液调节、维持细胞内的电子通透性和酸碱平衡等方面发挥着重要作用[20]。ANO1作为钙激活氯通道的分子基础，其在正常静止的心肌成纤维细胞中表达较弱，暗示钙激活氯通道在CFs正常生理状态下可能并未发挥太大功能。CFs分化为MFs后ANO1表达增强，从而调控细胞内氯离子的浓度及其分布，对细胞的功能产生影响。

CFs在心肌梗死、心力衰竭、高血压等病理状态下转化为MFs，在此过程中，细胞的增殖、迁移和分泌能力增强[21]。本研究初步阐明ANO1在CFs和MFs细胞的表达特征及其与CaCCs电流变化的关系，为下一步深入研究ANO1在CFs增殖、迁移、分泌及心肌纤维化进程中的调控机制奠定基础。