新型多胺代谢酶抑制剂SI-4650对结肠癌CT-26细胞增殖的影响及其机制*

黄娇娇，王艳林，孙丽丹，曹春雨，秦 烨，杨建林

(三峡大学 医学院 肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室，湖北 宜昌 443002)

多胺代谢途径作为抗肿瘤治疗的新靶点被广泛研究，以往研究证实，高多胺含量对肿瘤细胞的迅速生长至关重要，干扰肿瘤细胞的多胺代谢途径，耗竭多胺有效抑制肿瘤细胞的增殖[1]。精胺氧化酶(spermine oxidase, SMO)和乙酰多胺氧化酶(acetylpolyamine oxidase, APAO)是重要的多胺代谢酶，已有研究证实SMO高表达与胃肠癌等肿瘤的发生发展直接相关[2]，本课题组前期通过计算机辅助药物设计技术筛选出一种小分子的新型多胺代谢抑制剂，将其命名为SI-4650。研究发现SI-4650能够有效抑制人非小细胞肺癌A549细胞SMO和APAO酶活性，干扰多胺代谢，抑制细胞增殖并诱导肿瘤细胞发生凋亡和自噬性死亡[3]。为一步探究SI-4650抗肿瘤的潜能以及作用机制，本研究以结肠癌CT-26细胞为研究对象，进行体外验证SI-4650对CT-26细胞生长、凋亡和自噬的影响，为抗肿瘤药物研发提供基础依据和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

结肠癌CT-26细胞株购自上海柯雷生物技术有限公司；SI-4650购自Specs生物特殊化合物公司；细胞培养试剂包括：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗分别购自Gibco公司和天津市灏洋生物制品科技有限公司；3-MA自噬抑制剂购自Selleck公司；各种抗体：β-actin、PARP、Bax、Bcl-2、LC3-Ⅰ/Ⅱ、P62、Beclin-1和辣根过氧化物酶标记二抗分别购自CST公司、Santa Cruz公司、北京科美博瑞有限公司和北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL显影液购自Thermo Scientific公司；pEGFP-LC3质粒购自Add Gene公司；FITC-Annexin V 凋亡检测试剂盒、CCK8试剂盒、线粒体膜电位(JC-1)检测试剂盒和Fluo-3 AM探针均购自碧云天生物科技有限公司。

1.2 细胞培养、分组及处理

结肠癌CT-26细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞分为6组，0 μmol·L-1SI-4650处理48 h细胞为正常对照组；单独2.5 mmol·L-13-MA处理细胞为自噬抑制对照组，4个实验组分别为单独40 μmol·L-1SI-4650处理48 h细胞、单独80 μmol·L-1SI-4650处理48 h细胞、2.5 mmol·L-13-MA联合40 μmol·L-1SI-4650处理48 h细胞以及2.5 mmol·L-13-MA联合80 μmol·L-1SI-4650处理48 h细胞。

1.3 CCK8法检测CT-26细胞生长抑制率

分别用终浓度为0(正常对照)、10、20、40、80、160 μmol·L-1SI-4650处理CT-26细胞24、48、72 h，每个浓度设置6个复孔，同时设不加细胞的空白孔；在每孔中加入10 μl CCK8试剂后继续孵育30 min，用酶标仪于460 nm波长处检测每孔吸光度值(A)。SI-4650对CT-26细胞的生长抑制率=[1-(A实验组-A空白组)/(A正常对照组-A空白组)]×100%。

或以2.5 mmol·L-13-MA预处理CT-26细胞2 h后，用终浓度为0(正常对照)、40、80 μmol·L-1SI-4650继续处理细胞48 h，随后同上方法，使用CCK8检测计算细胞生长抑制率。

1.4 化学发光法分析CT-26细胞内SMO、APAO酶活性

根据参考文献[4]将收集到的0(正常对照)、40、80 μmol·L-1SI-4650处理48 h的CT26细胞中加入200 μl 0.083 mol·L-1甘氨酸缓冲液，-80℃冰箱中过夜裂解细胞，4℃、12 000 r·min-1离心10 min去除裂解细胞碎片，获得含有SMO和APAO的上清液，BCA试剂盒测定上清中总蛋白含量，化学发光法检测酶活性。以上清液中单位总蛋白质量(mg)、单位时间(s)内的平均化学发光强度(RLU)RLU/(mg·s)表示酶活性。

1.5 高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)检测CT-26细胞内多胺含量

收集0(正常对照)、40、80 μmol·L-1SI-4650处理48 h的CT26细胞，冰上裂解液作用细胞30 min，经离心后获得含多胺的上清液，BCA试剂盒检测上清液中总蛋白含量，分别取总蛋白含量相同的3个样品细胞裂解液，加入ddH2O使总体积为800 μl。随后在上清液中依次加入：内标分子20 μl DAH(1 mmol·L-1)、500 μl NaOH(2 mol·L-1)、10 μl 苯甲酰氯后振荡混匀，40℃水浴20 min后加入2 ml饱和NaCl溶液混匀，加入2 ml乙醚颠倒混匀后静置待分层，留取上层萃取液，将下层液体再次乙醚萃取2次，合并3次上层萃取液于通风橱中挥发干燥过夜。沉淀物用1 ml甲醇溶解并过滤，获得制备好的高效液相色谱分析样品。分析条件为：Luna C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)为固定相，乙腈-水(38∶62)为流动相，流速1 ml·min-1，检测波长254 nm，柱温30℃。以相同细胞总蛋白中多胺浓度μg/(ml·mg)体现相对多胺含量。

1.6 流式细胞术检测CT-26细胞周期

分别收集6个组CT-26细胞，经75%乙醇重悬后4℃固定过夜。PBS洗涤细胞后用含50 μg·L-1RNase、0.1% TritonX-100和0.5 g·L-1碘化丙啶(propidium iodide, PI)的PBS重悬细胞，37℃避光水浴30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

1.7 流式细胞术检测CT-26细胞凋亡

分别收集6个组CT-26细胞，按照试剂盒说明书操作，每样品细胞中加入5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI，室温下避光孵育15 min，流式细胞仪检测凋亡细胞数量，计算细胞凋亡率=[Annexin V(+)细胞数/总细胞数]×100%。。

1.8 流式细胞术检测CT-26细胞钙离子浓度

分别收集6个组CT-26细胞，按照试剂盒说明书操作，Fluo-3 AM钙离子荧光探针染色、洗涤后，用500 μl 1×PBS重悬细胞，流式细胞仪检测Fluo-3 AM与细胞内钙离子结合形成的绿色荧光强度确定细胞中钙离子浓度。

1.9 流式细胞术检测CT-26细胞线粒体膜电位

分别收集6个组CT-26细胞按照试剂盒说明书操作，JC-1试剂染色、洗涤后，用500 μl 1×PBS重悬细胞，流式细胞仪检测红色荧光和绿色荧光的比例，确定线粒体膜电位去极化的程度。

1.10 Western blot检测CT-26细胞凋亡和自噬相关蛋白表达

分别收集6个组CT-26细胞，100 μl 细胞裂解液冰上裂解30 min，4℃、12 000 r·min-1离心15 min，获取上清液。BCA试剂盒检测上清液总蛋白含量，每个样品分别取含60 μg总蛋白的上清液，加适量上样缓冲液，沸水浴10 min。蛋白样品经SDS-PAGE分离，电转至PVDF膜。5%脱脂牛奶(TBST配制)室温处理PVDF膜闭2 h，分别加抗体于4℃孵育过夜，经TBST洗膜后加对应二抗室温孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL化学发光法检测，以目的蛋白和内参照蛋白灰度值之比表示相对蛋白表达量。

1.11 统计学处理

2 结果

2.1 SI-4650对肠癌CT-26细胞增殖率的影响

CCK8法检测结果显示，SI-4650能有效抑制CT-26细胞增殖，且细胞增殖率随药物作用时间和浓度增加而下降，差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。后续实验中以终浓度为40、80 μmol·L-1SI-4650处理48 h的CT-26细胞作为实验组，以0 μmol·L-1SI-4650处理48 h的CT-26细胞作为正常对照组。

Tab. 1 Effects of SI-4650 on the proliferation rate of CT-26 cells(%, n=3)

2.2 SI-4650对肠癌CT-26细胞SMO与APAO酶活性及多胺质量浓度的影响

与正常对照组相比，40、80 μmol·L-1SI-4650处理组细胞SMO和APAO酶活性分别从12781.67(RLU)RLU/(mg·s)和8530.67(RLU)RLU/(mg·s)下降到4436(RLU)RLU/(mg·s)和2650.67(RLU)RLU/(mg·s)；与之相一致的是，处理组细胞中SMO酶促反应的底物精胺(spermine, Spm)含量从3.64 μg/(ml·mg)增多至5.05 μg/(ml·mg)，而反应产物精脒(spermidine, Spd)含量从 8.03 μg/(ml·mg)减少到2.92 μg/(ml·mg)，APAO酶促反应产物腐胺(putrescine, Put)含量也从3.12 μg/(ml·mg)下降为0.70 μg/(ml·mg)，同时细胞中总多胺含量也明显降低，以上差异均有统计学意义(P<0.01，表2)。提示SI-4650能有效抑制CT-26细胞中SMO和APAO酶活性，阻滞相应酶促反应进程，干扰多胺代谢，进而间接耗竭肿瘤细胞中总多胺含量。

Tab. 2 Effects of SI-4650 on activities of SMO and APAO and polyamine contents in CT-26 cells n=3)

2.3 SI-4650对肠癌CT-26细胞周期的影响

与正常对照组相比，40、80 μmol·L-1SI-4650处理可使CT-26细胞周期发生显著改变，G0/G1期从(35.33±0.11)%增加至(52.35±1.32)%，S期则从(51.63±0.80)%减少到(30.28±0.58)%(P< 0.05，表3)，提示SI-4650可将CT-26细胞阻滞在G0/G1期，干扰细胞增殖。

Tab. 3 Effects of SI-4650 on cell cycle of CT-26 cells(%, n=3)

2.4 SI-4650对结肠癌CT-26细胞自噬的影响

Western blot分析自噬相关蛋白的表达显示，与SI-4650 0 μmol·L-1正常对照组相比，40、80 μmol·L-1SI-4650处理的CT-26细胞中的自噬活化蛋白beclin-1、标志性自噬微管蛋白LC3-Ⅱ表达水平均随SI-4650浓度的增高而显著增加，自噬底物蛋白P62表达则随之减少，差异均有统计学意义(P<0.01，图1，表4)。以上结果提示SI-4650能诱导CT-26细胞发生自噬性死亡。

与单独0、40、80 μmol·L-1SI-4650处理 CT-26细胞相比较，联合2.5 mmol·L-1的自噬抑制剂3-MA预处理后，相同浓度的SI-4650作用CT-26细胞中beclin-1和LC3-II表达减少，P62表达增加，差异均有统计学意义(P<0.01，图2，表4)。结果提示 2.5 mmol·L-13-MA预处理可抑制SI-4650诱导CT-26细胞自噬的进程。

细胞自噬的发生对肿瘤细胞生长起保护性作用还是杀伤性作用目前尚未定论，为进一步探讨SI-4650诱导CT-26细胞自噬在抗肿瘤作用中是有益还有不利的因素，本研究通过细胞增殖实验证实，与SI-4650单独处理细胞组相比，联合使用3-MA抑制CT-26细胞自噬后，同样浓度的SI-4650对CT-26细胞的增殖抑制率分别从23.28%和36.34%下降为14.30%和19.39%(P<0.01，表5)。表明阻滞CT-26细胞自噬会减弱SI-4650对CT-26细胞生长的抑制作用。以上结果显示SI-4650诱导细胞自噬性死亡可能是抗结肠癌CT-26细胞分子机制之一。

Fig. 1 Effects of SI-4650 alone or in combination with 3-MA on autophagy of CT-26 cells

Tab. 4 Effects of SI-4650 alone or in combination with 3-MA on protein expressions of Beclin-I, P62, Lc3-I and Lc3-II after incubation of CT-26 cells

Tab. 5 Effects of 3-MA and SI-4650 on the proliferation rate of CT-26 cells(%, n=3)

2.5 SI-4650对结肠癌CT-26细胞凋亡的影响

与正常对照组相比，40、80 μmol·L-1SI-4650处理组凋亡细胞率从4.9%上升至7.69%和 16.87%，细胞中钙离子浓度增加，线粒体膜电位下降(P<0.01，表6)，同时细胞内标志性凋亡降解蛋白c-PARP表达水平增加，同时促凋亡蛋白Bax表达上调、凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下调、Bax/Bcl-2比值显著升高(P<0.01，图2，表7)。提示SI-4650可诱导CT-26细胞发生凋亡，其机制可能与线粒体依赖的细胞凋亡途径相关。

进一步研究显示，与单独40、80 μmol·L-1SI-4650处理 CT-26细胞相比较，当联合2.5 mmol·L-1的自噬抑制剂3-MA预处理后，相同浓度的SI-4650作用后凋亡细胞率分别从7.69%和16.87%下降至6.81%和13.94%(P<0.01，表6)，凋亡相关蛋白、细胞钙离子浓度和线粒体膜电位的改变程度均减弱(P<0.01，表6，表7)，以上结果提示自噬抑制剂3-MA可阻滞SI-4650诱导细胞凋亡，可能是通过干扰线粒体相关凋亡途径的进程实现的。

Tab. 6 Effects of SI-4650 alone or in combination with 3-MA on mitochondrial function and apoptosis of CT-26 n=3)

3 讨论

天然多胺(polyamine, PA)，包括腐胺(putrescine, Put)、精脒(spermidine, Spd)和精胺(spermine, Spm)，普遍存在于真核细胞当中紧密参与细胞的增殖、分化、发育和细胞应激等重要的生理过程。多胺代谢与包括肿瘤在内的多种疾病的发生与发展密切相关，细胞内多胺水平的稳定受到多胺合成酶、分解酶及其跨膜转运系统的严密调控[5]。APAO和SMO是多胺代谢关键酶，分别将N1-乙酰精脒、N1-乙酰精胺和Spm氧化为Put和Spd，同时生成3-乙酰氨基丙醛、3-氨基丙醛和H2O2[6]。本实验室前期基于药效团的计算机辅助药物设计技术和高通量虚拟筛选技术获得的一种多胺代谢酶新型小分子抑制剂SI-4650 也已证实具有抗人非小细胞肺癌A549细胞和骨肉瘤U87细胞增殖的药理学活性[3.7]。为探索SI-4650抗肿瘤机制及其是否具有抗结肠癌临床应用潜能，本实验研究SI-4650对结肠癌CT-26细胞增殖、凋亡和自噬的影响以及可能的分子机制，以期为开发更有效的结肠癌临床治疗新药提供理论和实验依据。

Fig. 2 Effects of SI-4650 alone or in combination with 3-MA on apoptosis-related proteins of CT-26 cells

Tab. 7 Effects of SI-4650 alone or in combination with 3-MA on apoptosis-related protein expressions of CT-26 cells n=3)

CCK8实验结果证实SI-4650能高效抑制CT-26细胞的增殖，且抑制效应随SI-4650作用时间和剂量增加而增加。进一步酶活性检测结果验证SI-4650有效抑制CT-26细胞中SMO 和APAO酶活性，且抑制效率随药物浓度增加而增高。同时高效液相色谱法分析多胺含量的结果也证实SI-4650可引起CT-26细胞中SMO 和APAO酶促反应产物Put、Spd的含量显著减少，同时细胞中总多胺含量也明显下降。我们推测，可能由于SI-4650抑制多胺代谢酶活性，引起N1-乙酰精脒、N1-乙酰精胺和Spm在细胞中堆积，从而活化细胞多胺代谢调控机制跨膜转运系统活化，导致大量多胺成分转运细胞外，进而细胞中总多胺含量下降，影响细胞增殖。以上结果提示SI-4650有效抑制CT-26结肠癌细胞增殖，其机制与SI-4650作为多胺代谢酶抑制剂，抑制CT-26细胞中SMO、APAO酶活性，阻滞酶促反应进行，减少细胞中总多胺含量相关。

SI-4650抗肿瘤机制研究发现，结肠癌CT-26细胞经SI-4650处理后，凋亡标志性蛋白c-PARP表达增加，促凋亡蛋白Bax 表达上调，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达则显著性下降，线粒体跨膜电位下降，同时可见细胞中钙离子浓度同步上升，可引起线粒体摄取超载而导致线粒体损伤，符合细胞凋亡[8-9]发生的分子改变。与此相一致的是，流式细胞仪检测显示SI-4650处理后FITC-Annexin V(+)凋亡细胞明显增多。以上结果提示，SI-4650通过线粒体途径诱导结肠癌CT-26细胞发生凋亡可能是其抗肿瘤机制之一。

本研究发现同时，随着SI-4650剂量的增加，CT-26细胞中自噬激活相关蛋白beclin-1、自噬活性标志性蛋白LC3-II表达水平均显著增加而自噬底物P62蛋白含量下降。以上结果说明SI-4650有效诱导结肠癌CT-26细胞发生自噬。

细胞凋亡和细胞自噬之间存在相互影响和相互关联的机制。二者能被多种应激刺激共同激活，共享多个调节分子，两者之间相互影响和相互联系共同调控细胞死亡[10-11]。为验证SI-4650抗CT-26肿瘤细胞作用中自噬与凋亡的相关性，本研究联合自噬抑制剂3-MA预处理后再使用SI-4650作用结肠癌CT-26细胞。结果发现，3-MA预处理有效减少SI-4650引起的自噬活化蛋白beclin-1和自噬标志蛋白LC3-II的表达，抑制SI-4650诱导的CT-26细胞自噬流进程；与此同时SI-4650诱导CT-26细胞凋亡的能力下降，凋亡细胞数减少，线粒体凋亡途径相关蛋白表达、线粒体膜电位以及细胞内钙离子浓度变化程度均显著下降；同时发现SI-4650对CT-26细胞增殖抑制率分别显著下降，说明3-MA抑制CT-26细胞自噬的过程中可能干扰细胞线粒体凋亡途径的顺利进行，导致SI-4650诱导肿瘤细胞凋亡作用同时下降，减弱SI-4650抗肿瘤效应。以上结果提示SI-4650诱导CT-26细胞凋亡和自噬是其抗肿瘤药理活性分子机制之一，SI-4650诱导CT-26发生自噬对肿瘤细胞起杀伤作用，而非保护性自噬，此过程中抑制自噬会阻滞细胞凋亡发生。因此推测SI-4650抗CT-26结肠癌机制中，自噬对凋亡起促进作用。

综上所述，SI-4650具有抗结肠癌CT-26细胞的药理学活性，机制可能与抑制多胺代谢酶活性，干扰多胺代谢，减少多胺总含量以及诱导细胞周期阻滞、细胞自噬和凋亡相关。本研究为以多胺代谢途径为抗肿瘤靶点的临床药物研发提供新的思路和研究基础。