超滤法分离刺五加果多糖及其抗氧化活性的研究①

沈 宇,赵宏博,赵 宏,王宇亮,王朝兴

(1. 佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007；2. 佳木斯大学康复医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

刺五加(Acanthopanax senticosus (Rupr. Maxim.) Harms)也称五加参，常以根和茎入药，但近年来研究发现其叶和果也是非常好的活性部位，具有较好的治疗和保健功效，开发前景广阔。刺五加中主要活性成分有刺五加多糖、刺五加苷、维生素、微量元素及氨基酸等，具有增强机体免疫力、抗菌、抗疲劳、抗氧化、抗病毒和抗衰老等功效[1～3]。超滤法是一种在分子水平上、无污染、高效节能的新型分离工艺。超滤是一种以压力为驱动力的膜分离技术，使用孔径不同的超滤膜对混合液体进行物理分离的过程，对比其他的滤膜，超滤膜过滤的精密度更高，膜孔更小[4]。适用于各类物质的分离、浓缩、纯化和精制，是目前应用最为广泛的膜分离技术。活性氧自由基是自由基在人体内与活性较强的含氧物质结合的产物，过多时会使核酸突变，是生物体衰老和患病的根源[5]。因而，抗氧化剂的研究和开发是现在科学研究的重点项目之一，尤其是开发来自天然产物的抗氧化剂。本实验采用刺五加的果实为原材料，采用水提取醇沉淀法提取刺五加果多糖。采用超滤法对刺五加果多糖进行分离，再分别对所得的各级多糖进行抗氧化活性的筛选，旨在找到抗氧化活性较好的组分，为刺五加果多糖抗氧化作用机制的进一步研究提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂

刺五加果(安国市光明饮片加工厂)； 1,1-二-2-苦肼基(DPPH，南京奥多福尼生物科技有限公司)；邻苯三酚(北京索莱宝科技有限公司)；葡萄糖标准品(美国Sigma公司)；牛血清白蛋白(美国Sigma公司)；苯酚(天津凯通化学试剂厂)。

1.1.2 仪器

KDM可调控温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；DZF-6050型真空干燥箱(上海恒平科学仪器有限公司)；DL-5-B低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂)； FW80型高速万能试样粉碎机(河北省黄骅市新兴电器厂)；膜分离机(曲阜市宏鑫机械厂)；中空纤维膜(湖州科滤膜技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 刺五加果多糖的提取[6]

称取1.5 kg刺五加果实，粉碎，加入蒸馏水(料液比1:30)浸泡过夜，设定提取温度95℃，提取时间115min，趁热过滤，浓缩，滤渣再以20倍蒸馏水浸泡过夜，按相同提取条件进行二次提取，趁热过滤，浓缩，合并滤液，冷却至室温，加入95%乙醇，醇浓度调至75%以上，低温静置24 h，在3000 r/min转速下离心15 min，取沉淀，蒸馏水复溶后，旋至无醇味，冷冻干燥，即得刺五加果粗多糖。

1.2.2 刺五加果多糖含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的绘制

精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品10mg，用蒸馏水定容至100mL容量瓶中，既得浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准品溶液。精密量取葡萄糖标准品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL和1.0mL，分别加入具塞试管中加蒸馏水至2mL，再分别加入5%的苯酚溶液1mL，充分摇匀，迅速加入浓硫酸5mL，摇匀后放置10min，置40℃水浴锅中保温15 min，取出后迅速冷却至室温，以蒸馏水用相同方法处理后为空白，使用紫外可见分光光度计在490nm波长处测定吸光度，以葡萄糖的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2.2 多糖含量的测定

精密称取刺五加果粗多糖样品20mg，蒸馏水定容至100mL容量瓶中，摇匀，得到0.2mg/mL的样品溶液。取2 mL待测样品溶液加入具塞试管中，按照1.2.2.1所述方法进行操作，根据葡萄糖标准曲线计算刺五加果多糖的含量。

1.2.3 三氯乙酸法脱蛋白

称取刺五加果粗多糖，蒸馏水超声溶解1h，冷却至室温，不断搅拌的同时加入体积比为1:1的5%三氯乙酸(TCA)溶液(W/V)，置4℃下冷藏24h，3000r/min离心15min，取上清液。加入饱和NaHCO3溶液调节pH至中性，浓缩后加入95%乙醇，并调节醇浓度在75%以上，常温下静置24h，3000r/min离心15min，取沉淀，真空干燥，即得刺五加果多糖。

1.2.4 蛋白质含量的测定

1.2.4.1 考马斯亮蓝染色液的配制

精密称取考马斯亮蓝G250标准品50mg，加入25mL 的95%乙醇，再加入50mL 的85%磷酸完全溶解，加蒸馏水定容至500mL容量瓶中既得浓度为0.01%的考马斯亮蓝染色液。

1.2.4.2 蛋白质标准曲线的制备

精密称取牛血清蛋白标准品10mg，蒸馏水溶解后定容至100mL容量瓶中，既得浓度为0.1mg/mL牛血清蛋白标准品溶液。精密量取标准品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置于试管中，加蒸馏水至1.0mL，再加0.01%考马斯亮蓝染色液5mL，摇匀，静置3min。用蒸馏水以相同方法处理后为空白，使用紫外可见分光光度计在595nm波长处测定吸光度，横坐标为牛血清蛋白的浓度，纵坐标为吸光度，绘制标准曲线。

1.2.4.3 蛋白质含量的测定

精密称取刺五加果多糖样品20mg，用蒸馏水定容至100mL容量瓶中，制得浓度为0.2mg/mL刺五加果多糖样品溶液。取刺五加果多糖样品溶液1mL，按照1.2.4.2所述方法进行操作，用紫外可见分光光度计在595nm波长处测定吸光度，利用蛋白质标准曲线计算样品的蛋白质含量。

1.2.5 超滤法分离刺五加果多糖

纯化后的刺五加果多糖溶于1000mL蒸馏水中，超声加热溶解1h，倒入超滤分离机的料箱中，超滤分离装置见图1。安装中空纤维膜组件(150kDa、100 kDa、50 kDa、10 kDa)，打开膜分离机电源开关，调节流量计使其保持恒速，调节控压阀使压力表指针在0.1MPa左右，未通过中空纤维膜的截留液流回料箱中，滤过液流向滤液罐，滤液用Molish反应来鉴别是否还含有多糖，直至Molish反应无现象时，即滤过液中不再含有多糖为止。料箱中加入蒸馏水关闭滤液口，进行反清洗，将黏附于中空纤维膜上的多糖样品清洗下来，与截留液合并。浓缩后的截留液中加入95%乙醇，调节醇浓度至75%以上，得醇沉液，常温静置24h，3000r/min离心15min，取沉淀，冷冻干燥，即得不同分子量分布的刺五加果多糖。

图1 超滤分离装置图1.料箱;2.流量计;3.压力泵;4.中空纤维膜;5.控压阀;6.压力表;7.滤液罐

1.2.6 刺五加果多糖的抗氧化活性筛选

1.2.6.1 DPPH清除能力的测定[7]

分别配置5个浓度梯度的各部分刺五加果多糖溶液各2.0mL，分别加入0.2mmol/mL的DPPH溶液各2mL于玻璃试管中，摇匀，避光静置0.5h后，用酶标仪于517nm处测定其OD值。以维生素C为阳性对照品，相同条件下，每一样品平行测3次，取其平均值。

多糖对DPPH的清除率公式为：

A0是样品溶液与DPPH溶剂混合液的OD值；A1是样品溶液与DPPH溶液混合液的OD值；A2是未加样品的溶液与DPPH溶液混合液的OD值。

1.2.6.2 超氧自由基O2-清除能力的测定

采用邻苯三酚法测定各部分刺五加果多糖对超氧自由基O2-的清除能力。将配置好的0.005mol/L的邻苯三酚溶液和pH为8.2的Tris-HCL缓冲溶液在25℃的恒温水浴锅中保温10min，取不同浓度的待测样品溶液各2mL，分别依次加入预热的Tris-HCL缓冲溶液3mL和邻苯三酚溶液 0.5mL，摇匀后，在25℃的恒温水浴锅中反应4min，加入一定量的HCl终止反应，用酶标仪于320nm处测定其OD值。以维生素C为阳性对照品，相同条件下，每一样品平行测3次，取其平均值。多糖对超氧自由基O2-的清除率公式为：

A0是空白对照组的OD值；A1是加入多糖样品溶液OD值。

2 结果

2.1 刺五加果多糖的提取结果

从1.5kg的刺五加果中提取得到的粗多糖为163.24g，刺五加果多糖的提取率为10.88%。

2.2 刺五加果多糖含量的测定结果

采用苯酚硫酸法测定各部分刺五加果多糖的含量，葡萄糖线性回归方程为y=13.52x+0.0104，R2=0.9991。刺五加果粗多糖中多糖的含量为46.75%，经脱蛋白处理，超滤分离后各部分多糖含量分别为分子量>100kDa组分多糖含量为67.28%；分子量100～50kDa组分多糖含量为61.32%；分子量50～10kDa组分多糖含量为88.15%；分子量<10kDa组分多糖含量为53.27%，见图2。从多糖的含量结果分析，刺五加果多糖中50～10kDa组分中的多糖含量最高，其次为>100kDa组分，含量最小的组分为低于10kDa的组分，但经纯化分离后的多糖各组分的含量均大于刺五加果粗多糖。

图2 各组分多糖含量测定

2.3 刺五加果多糖的除蛋白结果

标准牛血清白蛋白溶液的浓度对其在595nm波长处的吸光度作回归方程为Y =6.97x+ 0.0962，R2=0.9996。蛋白质标准曲线见图3。刺五加果粗多糖中的蛋白质含量为0.1267mg/mL，采用三氯乙酸法除蛋白后，蛋白质含量降为0.0566 mg/mL，蛋白质的脱除率为55.33%。

图3 牛血清白蛋白标准曲线

2.4 刺五加果多糖超滤法的分离

刺五加果多糖的超滤法分离结果见表1，各组分比例见图4。超滤法分离得到刺五加果多糖分子量>100kDa的组分为15.34g ，占多糖总量的19.0%；分子量在100～50kDa之间的组分为27.47g ，占多糖总量的34.0%，分子量在10～50kDa之间的组分为34.67g，占多糖总量的42.9%；分子量<10kDa的组分为3.25g，占多糖总量的4.1%。分离结果表明刺五加果多糖中相对分子质量在100～50kDa的组分含量最多，<10kDa的组分含量最少，不同分子量范围的多糖组分在含量上呈现不均一的分布。

表1 刺五加果多糖超滤法分离结果

图4 刺五加果多糖各组分比例

2.5 刺五加果多糖抗氧化活性筛选

2.5.1 DPPH·清除能力的测定

刺五加果多糖各组分对DPPH自由基的清除率见图5，不同分子量的刺五加果多糖组分对DPPH自由基均有不同程度的清除作用，并随其质量浓度的增大而增大，4个组分的质量浓度在0.6～1.0mg/mL时清除率增长缓慢，处于相对稳定的状态。清除率结果表明刺五加果多糖50～10kDa组分对DPPH自由基的清除率效果最好，清除率可达到56.89%，其次为100～50kDa组分，但与Vc阳性组比较对DPPH自由基清除能力相对较弱。

2.5.2 超氧自由基O2-清除能力的测定果

刺五加果多糖各组分对超氧自由基O2-的清除率见图6，不同分子量的刺五加果多糖组分对超氧自由基O2-均有不同程度的清除作用，并随其质量浓度的提高而具有一定的上升趋势，在0.5～1.5mg/mL的质量浓度范围内，清除率急剧增大，而在0.6～1.0mg/mL时清除率增长缓慢，处于相对稳定的状态。刺五加果多糖50～10kDa组分对超氧自由基O2-的清除率最好，清除率可达到40.69%，其次为100～50kDa组分，但与Vc阳性组比较对超氧自由基O2-清除能力相对较弱。

3 讨论

本研究采用优化的提取工艺提取刺五加果多糖，多糖提取率达到了10.88%，经三氟乙酸法脱除蛋白后，采用超滤技术对刺五加果多糖进行了分离和纯化，得到分子量为>100kDa组分、100～50kDa组分、50～10kDa组分和<10kDa组分，其中50～10kDa组分所占比例最高为42.9%，100～50kDa组分次之，并且各组分经分离后，多糖含量与粗多糖相比较都得到了一定的提高。因此，超滤技术是一种有效的分离和纯化多糖的手段，并且具有无污染、快速、准确的将多糖进行分子量分级的优点，从而提高了实验效率。为了比较分离后各个组分生物活性的高低，对分离后的4个组分进行了抗氧化活性的筛选，通过对DPPH和超氧自由基O2-清除能力的测定发现，各组分的抗氧活性略有不同，筛选出活性较好的组分为50～10kDa组分，其清除率分别为56.89%和40.69%，具有较好的抗氧化活性，具有进一步开发的价值。