解毒祛瘀滋肾方对MRL/lpr狼疮小鼠皮肤组织JAK1/STAT3信号通路的影响

浙江中医药大学附属第二医院 杭州 310005

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种慢性自身免疫性疾病，其免疫异常与细胞因子密切相关。在疾病活动期及组织损伤时常表现出细胞因子水平异常，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、干扰素（interferon，IFN）及白介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13和IL-15等水平上调，而上述细胞因子均可通过酪氨酸蛋白激酶/信号转导与转录激活因子家族（Janus kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT）信号通路发挥其生物学作用[1]。该通路上的关键信号分子包括酪氨酸蛋白激酶1（Janus kinase 1，JAK1）、信号转导与转录激活因子1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）、STAT3、STAT4、STAT6等。研究表明，JAK/STAT信号通路的异常激活与SLE的皮肤损害、肾脏炎症及中枢神经系统疾病有关[2]。

目前临床上SLE的治疗仍以糖皮质激素加免疫抑制剂为主，虽然能够有效控制疾病活动、改善病情，提高SLE患者的存活率，但也带来了严重的不良反应。实践证明，中医药在自身免疫性疾病的治疗中有着较大的潜力。解毒祛瘀滋肾方是范永升教授经长期临床实践总结出的治疗SLE的经验方[3-4]，临床和实验研究证明该方具有明显的抗炎、调节免疫、改善代谢紊乱、降低西药毒副作用及减少感染等作用，并且能显著改善皮肤损害（面部红斑、口腔溃疡、脱发、光过敏等）[5-7]，但目前具体机制尚不明确。因此，本研究拟探讨解毒祛瘀滋肾方对MRL/lpr狼疮小鼠皮肤组织JAK1/STAT3信号通路的影响，为阐明解毒祛瘀滋肾方治疗SLE的作用机制提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试剂及药品 JAK1抗体购于美国Abcam公司（批号：ab133666）；STAT3和β-actin单克隆抗体均购于武汉赛维尔生物公司（批号：GB11176、GB12001）；IL-6、IL-10酶联免疫吸附试验 （enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒均购于美国e-Bioscience公司（批号：109409011、107275015）；蛋白定量检测试剂盒、放射免疫沉淀法缓冲液、苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）、过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体、增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂盒均购自武汉赛维尔生物公司（批号：G2026、G2002、G2008、GB23301、G2014）。解毒祛瘀滋肾方由生地黄15g、炙鳖甲12g、青蒿12g、升麻9g、积雪草15g、赤芍12g、炒薏苡仁15g、佛手片9g、生甘草6g、白花蛇舌草15g组成，以上中药由浙江中医药大学附属第二医院中药房提供，并制成生药浓度为0.5g·mL-1的浓缩液；强的松片购于浙江仙琚制药股份有限公司（批号：150428），以蒸馏水溶解，制备成浓度为0.5mg·mL-1的混悬液。

1.2 主要仪器 ISO9001型电子天平购于德国Sartorius公司；Eppendorf 5417R型台式高速冷冻离心机为德国Eppendorf公司产品；V300型扫描仪购于EPSON公司；Thermo Multiskan MK3全自动酶标仪购于芬兰雷勃公司。

1.3 实验动物分组和干预 8周龄雌性无特殊病原体（specific pathogen free，SPF）级MRL/lpr小鼠30只和C57BL/6小鼠10只，均由上海斯莱克实验动物有限公司提供[实验动物生产许可证号码：SCXK（沪）2012-0005]。所有动物均于浙江中医药大学动物实验研究中心实验室全封闭SPF状态下饲养[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2018-0012]，自由采食饮水。 适应性喂养1周后，将MRL/lpr小鼠随机分为西药组（强的松组）、中药组（解毒祛瘀滋肾方组）和模型组，每组10只；另将C57BL/6小鼠作为对照组。中药组予解毒祛瘀滋肾方水煎剂灌胃，西药组予强的松片混悬液灌胃，模型组和对照组予0.9%氯化钠溶液灌胃。各组均每次灌胃体积均为0.01mL/g，1次/d，共8周。连续干预8周后，从眼眶静脉采血，室温静置4h，3 000r/min离心10min，分离血清样本，-80℃保存待用。采血后处死小鼠，选取皮损组织分成2份，一份用甲醛固定，另一份-80°C保存，以备蛋白表达检测。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 一般情况观察 观察各组小鼠的毛色光泽、脱毛情况、活动状态及颈部、腋下、腹股沟淋巴结肿大的情况。

1.4.2 血清免疫指标检测 采用ELISA检测试剂盒检测小鼠血清IL-6、IL-10含量，具体操作依据试剂盒说明书进行，根据标准品的含量及对应的光密度（optical density，OD）值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品含量。

1.4.3 皮肤组织病理学观察 将甲醛固定的小鼠皮损组织制成石蜡块，4μm切片后依次脱蜡脱水，苏木精-伊红（hema toxylin-eosin，HE）染色，分别在200、400倍光镜下观察各组皮肤病理改变情况。

1.4.4 皮肤组织JAK1和STAT3蛋白表达检测 取-80℃保存的小鼠皮损组织，采用Western blot法检测。皮肤组织块称重，利用液氮、研钵粉碎组织块，加入细胞裂解液，按说明书进行操作，提取的蛋白-20℃保存备用。取等量的蛋白提取物30μg（体积×蛋白质浓度），十二烷基硫酸钠-SDS经聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）电泳后转膜；分别加入JAK1、STAT3单克隆抗体 （稀释比例：1:1 000），4℃孵育过夜，以三乙醇胺吐温缓冲液（triethanolamine buffered saline solution-tween，TBS-T）洗涤3次，每次10min，加入二抗，4℃缓慢摇动孵育1h，洗涤后以ECL试剂盒进行化学发光，暗室曝光4min显像。将胶片进行扫描存档，Photoshop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标条带的光密度值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况结果比较 对照组小鼠皮毛和活动正常，颈部、腋下、腹股沟未见明显肿大的淋巴结；模型组小鼠皮毛晦暗枯槁、缺乏光泽，头部皮肤毛发缺损，肿大淋巴结数量明显增多；与模型组比较，中药组和西药组小鼠毛色、皮损明显减轻，均未见毛发缺损，中药组小鼠肿大淋巴结的数量明显减少，西药组未见明显肿大的淋巴结。

2.2 各组小鼠血清IL-6、IL-10含量比较 与对照组比较，模型组小鼠血清IL-6、IL-10含量均明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，中药组、西药组血清IL-6、IL-10含量均明显下降（P＜0.01）。与西药组比较，中药组血清IL-6含量差异无统计学意义（P＞0.05）；血清IL-10含量明显升高（P＜0.05）。见表1。表明解毒祛瘀滋肾方和强的松均能有效降低小鼠血清IL-6、IL-10含量，但解毒祛瘀滋肾方降低血清IL-10的能力弱于强的松。

2.3 皮肤组织形态学观察结果 对照组小鼠基底细胞未见明显液化变性，真皮层无明显淋巴细胞浸润。见图1A1～2。与对照组比较，镜下可见模型组小鼠真皮层被增生的结缔组织取代，可见大量成纤维细胞与纤维细胞，并有较多淋巴细胞与中性粒细胞浸润；皮肤表皮层基底细胞液化变性。见图1B1～2。中药组表皮层少见基底细胞液化变性，真皮层可见少量淋巴细胞浸润。见图1C1～2。与模型组比较，中药组小鼠皮肤组织基底细胞液化变性明显减轻，淋巴细胞浸润明显减少。西药组表皮层可见少量基底细胞液化变性，真皮层可见极少量淋巴细胞浸润。见图1D1～2。

表1 各组小鼠血清IL-6、IL-10含量比较（μg·mL-1，±s）Tab.1 Comparison of serum contents of IL-6 and IL-10 in each group（μg·mL-1，±s）

表1 各组小鼠血清IL-6、IL-10含量比较（μg·mL-1，±s）Tab.1 Comparison of serum contents of IL-6 and IL-10 in each group（μg·mL-1，±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与西药组比较，#P＜0.05Note:Compared with control group， *P＜0.05， **P＜0.01;compared with model group，△△P＜0.01;compared with western medicine group，#P＜0.05

组别 n IL-6 IL-10对照组 10 9.46±1.99 20.36±3.48模型组 10 39.28±8.73** 113.85±25.07**中药组 10 18.65±5.02**△△ 39.20±10.60**△△#西药组 10 15.79±5.18*△△ 28.01±7.25△△

2.4 各组小鼠皮肤组织JAK1和STAT3蛋白表达比较与对照组比较，模型组JAK1、STAT3蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，中药组、西药组JAK1、STAT3蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01）；与西药组比较，中药组JAK1、STAT3蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表2。

3 讨论

SLE作为一种典型的自身免疫性疾病，临床表现差异较大，通常包括皮疹、关节炎和肾炎等[8-9]。皮肤损害如颊部红斑、脱发、黏膜溃疡、盘状病变等是SLE最常见的临床症状之一，发生率80%～90%[10]。因其出现较早，且与病情密切相关，因此在SLE的诊断及治疗中有着重要的意义[11]。

SLE在中医学中属 “日晒疮”“蝴蝶斑”“阴阳毒”等范畴。实践证明，中医药在SLE的临床治疗中表现出较大的潜力，解毒祛瘀滋肾方是范永升教授临床治疗该疾病的经验方。SLE以肝肾阴虚为本，热毒血瘀为标，解毒祛瘀滋肾方以生地黄为君，清热凉血益阴；臣以白花蛇舌草、升麻清热解毒消斑，鳖甲补阴益肾退热；佐以赤芍、积雪草活血散血，青蒿退热开胃醒脾、疏理少阳气机；佛手、生甘草为使药疏理气机、调和诸药，诸药合用，标本兼治，共奏清热解毒、活血化瘀、益肾养阴之功。研究发现，解毒祛瘀滋肾方具有明显的抗炎、调节免疫、改善代谢紊乱、降低西药毒副作用及减少感染等作用，并且能显著改善SLE引起的皮肤损害[4，7，12]。 本研究中，与模型组比较，解毒祛瘀滋肾方干预后的MRL/lpr小鼠脱毛现象及皮肤病理损害均得到一定程度的改善，再一次验证了解毒祛瘀滋肾方对SLE皮肤损害的治疗作用。

图1 各组小鼠皮肤组织病理切片（HE染色）Fig.1 Pathological sections of skin tissue in each group （HE staining）

图2 各组小鼠皮肤组织JAK1、STAT3蛋白表达比较Fig.2 Comparison of protein expression of JAK1 and STAT3 in skin tissue in each group

表2 各组小鼠皮肤组织JAK1、STAT3蛋白表达比较（±s）Tab.2 Comparison of protein expression of JAK1 and STAT3 in skin tissue in each group（±s）

表2 各组小鼠皮肤组织JAK1、STAT3蛋白表达比较（±s）Tab.2 Comparison of protein expression of JAK1 and STAT3 in skin tissue in each group（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01Note:Compared with control group， *P＜0.05， **P＜0.01;compared with model group，△△P＜0.01

组别 n JAK1相对表达量 STAT3相对表达量对照组 10 0.076±0.040 0.092±0.065模型组 10 0.596±0.186** 0.629±0.215**中药组 10 0.197±0.486*△△ 0.230±0.106*△△西药组 10 0.235±0.087**△△ 0.336±0.141**△△

SLE疾病活动期表现出T、B淋巴细胞的过度活化、细胞因子网络失衡。IL-6、IL-10是辅助性T细胞2（helper T lymphocyte 2，Th2）分泌的细胞因子，在SLE活动期血清IL-6、IL-10含量上调，能够促进B细胞的增殖分化，并可通过JAK1/STAT3通路刺激自身抗体产生，进而导致循环免疫复合物堆积，引起组织和器官损伤[13-15]。JAK/STAT是一种多效联级信号通路，主要传导细胞增殖凋亡以及免疫调节等信号，是大量细胞因子和生长因子信号传导的主要途径，其中也包括IL-6、IL-10。IL-6、IL-10分别通过与白介素-6受体（interleukin-6 receptor，IL-6R）、白介素-10受体（interleukin-10 receptor，IL-10R） 结合， 启动JAK1/STAT3信号转导通路。IL-6、IL-10分别与相应受体结合后，产生IL-6/IL-6R、IL-10/IL-10R复合体，促使JAK1活化，进而促进STAT3的酪氨酸残基磷酸化，使STAT3与其受体分离，形成同源或者异源二聚体，转移到细胞核中并与靶基因结合，调控基因转录[16]。研究表明在SLE疾病过程中，调节血清细胞因子水平和抑制JAK/STAT3信号通路均可抑制自身抗体的产生[17]，缓解疾病状态。本研究中，与对照组比较，模型组小鼠血清IL-6、IL-10含量明显增高，皮损组织中JAK1、STAT3蛋白表达水平也明显增高。经强的松、解毒祛瘀滋肾方治疗后血清IL-6、IL-10含量明显降低，皮肤组织JAK1、STAT3蛋白表达亦明显降低。与西药组比较，中药组血清IL-6含量及皮损组织中JAK1、STAT3蛋白表达水平差异无统计学意义，但血清IL-10含量明显升高。以上研究结果表明，解毒祛瘀滋肾方、强的松均能有效降低小鼠血清IL-6、IL-10含量，并能有效抑制皮肤组织JAK1、STAT3蛋白表达，但解毒祛瘀滋肾方降低血清IL-10的能力弱于强的松。

综上所述，本研究在前期临床观察基础上探讨了解毒祛瘀滋肾方对SLE皮损组织JAK/STAT信号通路的影响。结果表明，解毒祛瘀滋肾方有抗炎、免疫调节等多方面的作用，其作用机制可能与抑制JAK/STAT信号通路的过度激活有关。后续研究将进行其他信号通路相关指标检测，以进一步明确解毒祛瘀滋肾方对SLE的多靶点作用机制。