虎杖苷对丙酮醛诱导施万细胞损伤的干预作用

陈露露，祁佐良

中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院，北京100144

难治性创面修复是修复重建外科领域的一大难题。由糖尿病引起的周围神经及其相应营养血管的结构和功能障碍是导致难治性创面的非常重要的原因。大量动物实验和临床研究表明，丙酮醛(MGO)和糖基化终产物(AGE)的堆积在周围神经病变及血管病变中起到了至关重要的作用[1]。虎杖苷(PD)是从植物虎杖中提取的单体，具有多种生物学活性和广泛的药理学作用[2～6]。近年来，PD对糖尿病相关心血管及肾脏疾病的治疗作用已被广泛研究[7～9]，但其对糖尿病周围神经病变的影响尚不明确。为初步探讨PD对周围神经系统的影响，2016年4月～2018年4月，我们以周围神经系统中的胶质细胞——施万细胞作为研究对象，采用MGO体外损伤施万细胞以模拟体内糖尿病周围神经病变模型[10]，观察PD预处理后施万细胞的活性变化及凋亡情况，探讨PD对施万细胞的保护作用，为临床上难治性创面和周围神经病变的修复提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与主要材料 大鼠施万细胞系RSC96取自中国科学院。高糖DMEM培养基购自美国Thermo公司。0.25%胰酶、青霉素-链霉素溶液、胎牛血清(FBS)均购自加拿大Gibco公司。二甲基亚砜(DMSO)购自上海生工生物工程有限公司。磷酸盐缓冲液(PBS)、0.4% MGO工作液、PD、4%多聚甲醛溶液(PFA)、1% TritonX-100、荧光封片剂购自美国Sigma公司。CCK-8试剂盒购自碧云天公司。兔多克隆一抗购自英国Abcam公司。羊抗兔IgG荧光二抗、TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司。TUNEL染色试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。荧光定量RT-PCR引物由北京擎科生物科技有限公司合成。GAPDH上游引物序列为5′-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTA-3′，下游引物序列为5′-TGGTAACCAGGCGTCCGATA-3′；Caspase-3基因上游引物序列为5′-GCTGGACTGCGGTATTGAGA-3′，下游引物序列为5′-CCATGACCCGTCCCTTGA-3′。

1.2 细胞分组及干预方法 施万细胞采用高糖DMEM培养液于37 ℃、5% CO2条件培养箱中培养，当生长至90%融合时采用0.25%胰酶进行消化传代，并以(1～2)×105/mL重新接种培养以进行后续实验。将细胞采用4% PFA固定和10%羊血清封闭后，加入GFAP抗体、MBP抗体(0.5% BSA稀释)和羊抗兔二抗行免疫荧光染色以鉴定细胞特性。将施万细胞分为空白对照组、MGO组、PD组。空白对照组细胞体外培养48 h后改用无血清培养基培养，不加入任何药物处理。MGO组细胞体外培养48 h后改用无血清培养基培养12 h，随后加入1.65 mmol/L的MGO分别培养6、24 h。PD组细胞培养48 h后改用无血清培养基，同时分别加入50、100、200、300 μmol/L的PD培养12 h，随后加入1.65 mmol/L的MGO分别培养6、24 h。

1.3 细胞活性检测 吸除96孔板中各组细胞的上清液，PBS清洗后，每孔加入100 μL的无血清DMEM培养液和10 μL的CCK-8试剂。将96孔板放入培养箱内孵育2 h，随后吸取上清液于新96孔板中。最后采用酶标仪测定各孔450 nm波长处吸光度(A)值。细胞活性=(实验孔A值-空白孔A值)/(对照孔A值-空白孔A值)×100%。对照组细胞活性设为100%。

1.4 细胞凋亡检测 采用TUNEL染色试剂盒进行染色。细胞样本采用4% PFA固定30 min后用PBS清洗，加入1% TritonX-100室温放置3～5 min后用PBS清洗。细胞中加入100 μL配好的反应液，37 ℃孵育30 min，随后PBS清洗。吸干水分后，加入50 μL的TdT酶反应液，37 ℃避光孵育60 min，随后PBS清洗。吸干水分后，加入50 μL的TdT酶反应液，37 ℃避光孵育60 min，PBS清洗。加入50 μL的Streptavidin-TRITC标记液，37 ℃避光孵育30 min，随后PBS清洗。最后DAPI染细胞核10 min，PBS清洗，封片剂封片。于荧光显微镜下(100×)随机拍摄6个视野照片，计算TUNEL阳性细胞率即为细胞凋亡率。

1.5 细胞中Caspase-3 mRNA检测 采用RT-PCR法。将各组待检测细胞移去培养液后PBS清洗。加入1 mL的TRIzol反复吹打，加入氯仿400 μL，震荡30 s，4 ℃静置15 min后以12 000 r/min、4 ℃离心15 min。取上层无色液体，加入相同量的异丙醇，颠倒混匀静置10 min后以12 000 r/min、离心半径8 cm、4 ℃离心10 min。舍弃上清，加入75%乙醇以7 500 r/min、4 ℃离心5 min。用40 μL的DEPC水溶解RNA，分光光度计测定浓度。按每管2 μg RNA进行逆转录。PCR反应体系12 μL包括4 μL的Buffer、1 μL的酶抑制剂、1 μL的Oligo、1 μL的逆转录酶、1 μL的dNTP、RNA及水。反应条件为30 ℃、10 min，42 ℃、60 min。最后所得样本以4 ℃保存。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量[11]。

2 结果

2.1 各组细胞活性比较 损伤处理后6、24 h，MGO组细胞活性低于空白对照组，PD组细胞活性高于MGO组(P均<0.05)；PD组中，100 μmol/L PD处理的细胞活性高于50 μmol/L，而200、300 μmol/L PD处理的细胞活性低于100 μmol/L(P均<0.05)，提示PD浓度为100 μmol/L时对施万细胞RSC96具有最佳的保护作用，而200、300 μmol/L浓度可能对细胞已经具有损伤作用。因此在后续凋亡实验中，PD组选择100 μmol/L亚组的数据进行分析。具体结果见表1。

表1 不同损伤处理时间各组细胞活性比较

2.2 各组细胞凋亡率比较 损伤处理后24 h各组细胞凋亡率均高于损伤后6 h(P均<0.05)；损伤处理后6、24 h，MGO组细胞凋亡率高于空白对照组，PD组细胞凋亡率低于MGO组(P均<0.01)。见表2。

表2 不同损伤处理时间各组细胞凋亡率比较

2.3 各组细胞中Caspase-3 mRNA表达比较 损伤处理后6、24 h，MGO组细胞Caspase-3 mRNA相对表达量高于空白对照组，PD组细胞Caspase-3 mRNA表达低于MGO组(P均<0.05)。见表3。

表3 不同损伤处理时间各组细胞中Caspase-3 mRNA表达比较

3 讨论

周围神经系统是由胶质细胞(即施万细胞)和神经元细胞组成，其功能异常的原因多见于外伤或自身疾病。在自身疾病中，由糖尿病引起的末梢周围神经病变在临床中最常见。糖尿病神经病变是指体内长期的高血糖引起神经系统出现各种病理生理异常从而产生的神经系统损害，其中末梢周围神经系统最常受累。糖尿病周围神经病变是一个长期的过程，具体发病机制尚不十分清楚，可能包含多种途径的激活，如MGO和AGE的大量堆积、氧化应激反应、蛋白激酶C通路的活化、多元醇通路的激活等[12]。由于其产生机制十分复杂，目前很难在体外完全模拟出体内的神经病变。

高糖引起的MGO、AGE的形成和大量堆积是糖尿病周围神经病变发生的主要机制之一[1,13]。MGO是AGE的二羰基前体，在正常机体内其水平很低。糖尿病患者体内MGO的含量异常增高，大量聚集的MGO可引起组织细胞损伤，还可通过生成AGE对机体产生明显的毒性作用[14]。鉴于以上原因，目前许多研究采用MGO体外损伤刺激细胞来间接模拟糖尿病病损[9,10]。施万细胞是周围神经系统特有的胶质细胞，在周围神经系统的发育和再生中发挥着至关重要的作用。当机体发生糖尿病周围神经病变时，施万细胞出现反应性、增生性和退行性改变，发生凋亡、坏死，进一步导致神经轴突出现病理损害，最终使周围神经发生不可逆损伤[15]。因此，保护施万细胞的结构和功能是防治糖尿病周围神经病变中不可或缺的重要环节。

PD是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，属于一种芪类化合物，具有多种药理学作用。其分子中含有3个酚羟基，为一种氧自由基清除剂，可通过调节活性氧的产生和保护线粒体功能来发挥强效抗氧化和抗炎作用[16,17]。与白藜芦醇相比，PD的抗氧化、清除氧自由基的能力更强[18]。PD的抗衰老及对中枢神经、心肌、肝脏、肺脏等的保护作用已被大量报道[16]。本研究以施万细胞为研究对象，以MGO诱导损伤，并观察PD的干预作用。本研究结果显示，PD预处理能有效地减弱MGO对施万细胞RSC96的损害，维持细胞活性，抑制细胞凋亡，且在细胞损伤早期(6 h)和晚期(24 h)均表现出稳定的保护作用。这提示PD对糖尿病周围神经病变具有一定的防治作用。值得一提的是，PD组中的200、300 μmol/L PD处理的细胞活性明显低于100 μmol/L，说明200 μmol/L的PD已经呈现毒性作用，PD只有在一定浓度范围内才能更好地发挥保护功能。

目前认为，经典的凋亡途径分为三条，即线粒体途径、死亡受体途径及内质网途径[19]。三条途径中除了线粒体途径中的AIF途径(通过线粒体释放直接诱导凋亡)，其他途径都可经过Caspase家族的激活实现凋亡。在Caspase家族中，Caspase-3是最重要的效应性蛋白裂解酶，是细胞凋亡信号下游的关键执行者。本研究结果显示，施万细胞经MGO处理后，细胞凋亡率和细胞中Caspase-3 mRNA表达水平明显增高，说明MGO具有明显的诱导凋亡作用；而PD预处理可有效减少细胞凋亡率和Caspase-3 mRNA表达，证实PD可通过抑制施万细胞的凋亡达到保护细胞的作用。

结合上述研究结果，我们认为，PD预处理可减轻MGO诱导的施万细胞损伤，维持细胞活性，减少细胞凋亡。本研究结果为临床应用PD防治周围神经病变提供了理论参考。