施氮量和采收时期对油蔬两用型油菜菜薹维生素合成的影响

林宝刚 怀 燕 李志平 柳 寒 任 韵 张冬青 余华胜 华水金,*

(1 浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所， 浙江 杭州 310021； 2 浙江省农业技术推广中心， 浙江 杭州 310020；3 内蒙古自治区农业技术推广站， 内蒙古 呼和浩特 010011； 4 湖州市农业科学研究院， 浙江 湖州 313000)

油蔬两用型油菜菜薹深受消费者青睐和种植者欢迎。油菜薹具有较高的营养价值，富含维生素C、维生素E、维生素B族等多种维生素和锌、硒等对人体有利的微量元素[1-2]。油蔬两用型油菜品种在合理栽培措施下，既能保证油菜籽粒不减产，又能通过出售油菜薹，增加油菜种植者收入，提升油菜种植效益[3-4]。

维生素是人类健康必不可少的营养因子。人体中所需的维生素大部分从植物性食品中摄取。因此，植物组织中的维生素含量是决定其营养价值的重要参考指标之一。有关植物组织细胞内维生素类物质的合成和代谢途径已经开展了大量研究。如维生素C合成的L-半乳糖途径、邻酮醛糖途径等[5-6]；天然维生素E合成的第一步由类异戊二烯合成途径和酪氨酸降解途径分别生成疏水尾部和芳香环头部，然后由叶绿醇焦磷酸与尿黑酸缩合成2-甲基-6-叶绿醇质体醌，最后在生育酚甲基转移酶和生育酚环代酶等作用下经过甲基化和两边环代形成维生素E[7]；维生素B1由嘧啶和噻唑在细胞内合成[8]。综上可知，植物体内维生素类物质合成途径均与碳、氮化合物代谢密切相关，因此，推测油菜薹维生素类物质的合成可能受氮肥的调节。

植物组织维生素积累与栽培措施和环境密切相关[9-12]。施氮是影响作物产量和品质的关键栽培措施之一。已有大量研究表明，施氮能够促进油菜产量，并降低油菜籽粒含油量[13-15]。但施氮对油蔬两用型油菜菜薹品质的影响鲜见报道。油菜薹是油菜茎秆抽薹到一定高度时采收茎秆顶端幼嫩部分的产品。有研究表明，于油菜株高40 cm左右时，采收茎秆顶端15 cm菜薹为宜[16-17]。然而，不同采收时期对油菜薹品质的影响则少有研究。因此，为明确施氮量和采收时期对油菜薹品质形成的调控，本研究开展了不同氮肥用量和采收时期对菜薹维生素类物质含量、维生素C合成与代谢过程中关键酶活性的变化以及维生素家族关键基因表达量影响的研究，旨在为油蔬两用型油菜品种栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验地概况

供试材料为油蔬两用型油菜品系富硒1号，由浙江省农业科学院油菜育种与栽培研究室提供。试验于浙江省杭州市余杭区良渚镇麟海蔬果专业合作社进行，试验地土壤养分含量为全氮635.0 mg·kg-1、速效磷74.5 mg·kg-1、速效钾99.2 μg·kg-1。

1.2 试验设计

试验采用裂区试验设计，主处理为3个氮肥梯度：施用纯氮120、180和240 kg·hm-2(以N1、N2和N3表示)；副处理为4个菜薹采收时期：以株高20、30、40和50 cm代表(以H0、H1、H2和H3表示)，每个小区设3个重复，小区面积13 m2，种植密度为120 000株·hm-2。 2018年10月5日播种，穴直播，每穴播种约5粒种子。每小区氮肥(尿素)施用量按照纯氮量进行折算后均匀施入土壤，60%作为基肥，10%作为提苗肥(五叶期)，30%作为薹肥；磷肥(过磷酸钙，870 kg·hm-2)、 钾肥(氯化钾，200 kg·hm-2)和硼砂(1 kg·hm-2)作为基肥一次性施入土壤中。待油菜长至三叶一心时，间苗一次，五叶期进行定苗。油菜生育期内水分、病虫害管理同常规。

当每小区75%的植株达到采样株高时开始采样，每小区随机取60个油菜薹(小区边界植株除外)。采菜薹时从花蕾顶部往下切取10 cm，用于营养成分检测的油菜薹置于装有碎冰块的保温泡沫盒，立即运回实验室进行测定；用于酶活性和基因表达分析的油菜薹立即置于液氮冷冻后运回实验室，并于-80℃ 超低温冰箱保存，待用。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 还原型维生素、脱氢抗坏血酸、维生素E、维生素B1和维生素B6含量测定 还原型维生素C(ascorbic acid，AsA)和氧化型维生素C(dehydroascorbate，DHA)含量根据赵云霞等[18]的方法测定；维生素B1和B6含量分别采用高效液相色谱法和微生物法测定[19-20]。

1.3.2 维生素C代谢相关酶活性检测 半乳糖内酯脱氢酶(L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase，GalLDH)活性参照马春花等[21]的方法测定。抗坏血酸过氧化物酶(ascorbateperoxidase，APX)、脱氢抗坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase，DHAR)和单脱氢抗坏血酸还原酶(monodehydroascorbate reductase，MDHAR)活性参照吴锦程等[22]的方法测定。抗坏血酸氧化酶(ascorbate oxidase，AAO)活性参照余泽高等[23]的方法测定。

1.3.3 维生素类物质合成途径关键酶基因表达分析 油菜薹RNA提取采用QIAGEN RNeasy Plant Mini试剂盒(Cat. No.74903，德国Qigen)，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(RR407A)反转录试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司]进行反转录，合成cDNA备用。分别选择维生素C、维生素E、维生素B1和维生素B6合成途径中编码关键酶的基因进行表达量分析。每种维生素合成过程中关键酶基因的序列首先与相对应的拟南芥基因序列比对，然后在油菜基因组数据库中搜寻对应的油菜位点(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)。基因表达量检测所用引物见表1。使用LightCycler480荧光定量仪(Roche，瑞士)进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测。采用TB Green®PremixExTaqTMⅡ(No. RR820B)试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司]进行扩增。反应体系为：TB GreenPremixExTaqⅡ(Tli RHase H Plus)2×10 μL，上游引物和下游引物各0.2 μmol，cDNA 0.2 μg，用无RNase的灭菌水补足至20 μL；两步法进行PCR扩增：95℃预变性30 s，循环1次；95℃变性5 s，60℃退火20 s，循环40次；95℃变性5 s，60℃退火1 min。以油菜ACTIN作为参考基因，采用2-ΔΔCT方法计算相对基因表达水平。比较不同施氮量对油菜菜薹维生素合成关键基因表达量时，以120 kg·hm-2处理油菜薹基因表达量作为对照加以表征(即以120 kg·hm-2处理的油菜薹基因表达量为1，其余氮肥处理的油菜薹基因表达量表示为相对于120 kg·hm-2处理的油菜薹基因表达量的倍数)；比较不同株高油菜薹维生素合成关键基因表达量时，以株高20 cm时采收的油菜薹基因表达量为对照。

1.4 数据分析

数据均采用平均值±标准误表示。各平均值之间的差异采用Duncan’s法分析。基因表达量采用R 3.6.3软件包进行热图分析并作图。

2 结果与分析

2.1 施氮量和采收时期对油菜薹维生素类物质含量的影响

由表2可知，株高20 cm时采收的油菜薹中AsA和DHA含量是其他株高采收处理的2.63～5.05倍和1.09～3.44倍。在该株高时采收，AsA含量随着施氮量的增加而降低；DHA含量趋势相反。同一施氮量条件下，随着油菜薹采收株高的增加(从30至50 cm)，AsA含量有小幅度回升趋势；但DHA含量降低。在3个氮肥水平下DHA含量与采收株高的相关系数分别达到了-0.886、-0.954和-0.920。在相同株高采收时(30 cm起)，AsA和DHA含量随着施氮量的增加而降低。

施氮量120和180 kg·hm-2处理的维生素E平均含量差别较小，但均远高于施氮量240 kg·hm-1处理，分别较其增加了16.5%和20.6%。施氮量120和180 kg·hm-2处理于株高40 cm时采收的菜薹中维生素E含量最高；施氮量为240 kg·hm-2处理于株高20 cm时采收的菜薹维生素E含量最高，其次为株高40 cm时采收。

施氮量从120增至180 kg·hm-2时，维生素B1和维生素B6含量平均分别增加了14.3%和9.3%；继续增施氮肥至240 kg·hm-2后，维生素B1含量增加不明显，维生素B6含量则较施氮量180 kg·hm-2处理减少了1.6%。3个氮肥处理下，维生素B1含量均表现为株高40 cm采收时最高。施氮量120 kg·hm-2处理于株高30 cm时采收的菜薹维生素B6含量最高；施氮量180和240 kg·hm-2处理下则均表现为株高50 cm采收时最高。

表2 不同施氮量和采收株高对油菜薹AsA、DHA、维生素E、维生素B1和维生素B6含量影响Table 2 Effect of nitrogen application rate and plant height on ascorbic acid, dehydroascorbate, vitamin E, vitamin B1, and vitamin B6content in young stem of rapeseed

2.2 施氮量和采收时期对油菜薹维生素C代谢相关酶类活性的影响

由表3可知，维生素C合成关键酶GalLDH、氧化还原代谢关键酶APX和MDHAR的平均酶活性在施氮量180 kg·hm-2处理下分别较施氮量120和240 kg·hm-2处理高3.2%和47.3%、3.8%和10.8%、19.7%和11.4%。在施氮量120 kg·hm-2处理下，GalLDH活性在株高40 cm采收时最高，APX和MDHAR活性在株高30 cm采收时最高；在施氮量180 kg·hm-2处理下，GalLDH和APX活性在株高40 cm采收时最高，而MDHAR活性在株高30 cm采收时最高；在施氮量240 kg·hm-2处理下，GalLDH活性在株高50 cm采收时显著高于其他采收时期，MDHAR活性在株高50和30 cm采收时无显著差异，但显著高于20和40 cm采收时期，APX活性在株高20 cm采收时最高。

AAO和DHAR活性整体随着施氮量的增加而增加，AAO和DHAR活性与施氮量之间的相关系数分别达到了0.999和0.998，表明氮肥能够显著促进这两种酶活性的增加。在施氮量120和180 kg·hm-2处理下，AAO活性均在株高40 cm采收时最高；DHAR活性则在株高30 cm采收时最高。当施氮量增加至240 kg·hm-2时，菜薹中的AAO活性随着株高的增加而增加，AAO活性与株高的相关系数达到了0.932；DHAR活性在株高50 cm采收时最高，分别较株高20、30和40 cm采收时增加了31.3%、4.5%和21.6%。

2.3 不同施氮量和采收时期对编码油菜薹维生素类物质代谢关键基因的表达量影响

2.3.1 以施氮量120 kg·hm-2处理为对照 由图1可知，APX家族基因在施氮量为240 kg ·hm-2(N3)处理下，株高40 cm(H2)采收时表达量最高，且均为上调；随着施氮量的增加，株高20(H0)和50 cm(H3)采收时全部APX家族基因表达量均下调(除APX1表达量在施氮量240 kg·hm-2处理下株高20 cm采收时上调)；各施氮量处理下，株高30(H1)和40 cm采收时，7个APX家族基因中APX6的表达量均最高。GalLDH、DHAR1和AAO在施氮量180(N2)和240 kg·hm-2处理下，株高30 cm采收时其表达量均上调，但施氮量180 kg·hm-2处理高于施氮量240 kg·hm-2处理。MDHAR在施氮量240 kg·hm-2处理下，株高40 cm采收时表达量最高。

表3 不同施氮量和采收株高对油菜薹AAO、APX、DHAR、GalLDH和MDHAR活性的影响Table 3 Effect of nitrogen application rate and plant height on AAO, APX, DHAR, GalLDH, and MDHAR activity in young stem of rapeseed

维生素E代谢家族基因在株高30和40 cm采收时，随着施氮量的增加主要表现为正调控。除TMT和HPD的表达量较高外(5～10倍之间)，其余基因的表达量较低，均在5倍以内。在株高20和50 cm采收时，GGDPR、GGPS1、GGPS2和TMT基因均为负调控，且随着施氮量的增加其下调程度加强。在施氮量180和240 kg·hm-2处理下，VTE和HPD的表达量在株高20 cm采收时为上调，在株高50 cm采收时为下调；在株高20和50 cm采收时施氮量对TPT1表达量的影响与VTE和HPD的趋势相反。

维生素B1家族基因THIC和HMPPK在株高30和40 cm采收时，其表达受施氮量的正调控，且施氮量240 kg·hm-2处理的表达量高于施氮量180 kg·hm-2处理；在施氮量180和240 kg·hm-2处理下，PDX1.1的表达量均高于PDX1.2和PDX2；PDX1.1在施氮量180和240 kg·hm-2处理的表达量比施氮量120 kg·hm-2处理高6倍以上。在株高20 cm采收时，随着施氮量的增加维生素B家族基因除PDX1.1(施氮量180 kg·hm-2处理)外，均为下调模式，且下调量接近。在株高50 cm采收时，THIC表达量随着施氮量的增加其上调程度加强，其余基因表达量则为下调，且下调量相比株高20 cm采收时更大。

注：红色代表上调，蓝色代表下调。下同。以施氮量120 kg·hm-2为对照。Note: Red box represented up regulation and blue box represented down regulation. The same as following. The control was nitrogen application rate at 120 kg·hm-2.图1 不同施氮量和采收时期处理下菜薹中维生素C(A)、维生素E(B)、维生素B1和B6(C)相关基因表达量变化Fig.1 The expression amounts of genes encoding vitamin C (A), vitamin E (B), vitamin B1, and vitamin B6 (C) under different nitrogen application rates and harvesting heights in young rapeseed stem

2.3.2 以株高20 cm处理为对照 由图2可知，维生素C代谢相关的APX家族基因中的APX5、APX6和TAPX基因在3种氮肥处理下始终表现为正调控，且表达量为TAPX>APX6>APX5。在施氮量120 kg·hm-2处理下，随着菜薹采收株高的增加，APX6和TAPX基因的表达量也相应上调，而APX5则变化不明显；在施氮量180 kg·hm-2处理下，APX5、APX6和TAPX基因均随着菜薹采收株高的增加而逐渐降低。所有处理中，TAPX表达量在施氮量180 kg·hm-2处理下，株高30 cm采收时最高。APX1、APX4和SAPX基因的表达量在3种氮肥处理下相比于株高20 cm采收时，随着株高的增加主要表现为下调。GalLDH基因的表达量在3种氮肥处理下，于30～50 cm各采收株高主要表现为上调；且在施氮量180 kg·hm-2处理下，株高30 cm采收时表达量达到最高，是株高20 cm采收时的15倍以上。AAO基因则相反，在所有施氮量和株高处理下，其表达量相对于株高20 cm采收时均为下调，且其下调量达5倍以上。MDHAR和DHAR1在各氮肥水平下，随着采收株高的增加，以正向调控主，但是无论是正向还是负向调控，其表达量的变化相对较小。

维生素E家族基因在不同施氮量下，随着株高的增加，主要呈正向调控模式，说明该家族基因在株高30 cm以上的菜薹中较为活跃。GGDPR和HPD基因的表达量在3种施氮量和3个采收时期处理下高于其他基因的表达量。在施氮量120 kg·hm-2处理下，随着株高的增加GGDPR和HPD表达量先增后降；在施氮量180和240 kg·hm-2处理下，GGDPR和HPD表达量随着株高的增加而降低，且在株高30 cm采收时2个基因的表达量均为株高20 cm采收时的15倍左右。

维生素B族家族基因除PDX1.2在各施氮量和不同采收时期处理下主要表现为负向调控外，其余基因均表现为正向调控。PDX1.1和THIC的表达量的上调幅度在各施氮量和采收时期处理下均高于其他基因。PDX1.1的表达量在施氮量240 kg·hm-2，株高40 cm采收的采薹中最高，是株高20 cm采收时的17.1倍。THIC的表达量在施氮量180 kg·hm-2，株高50 cm采收时最高，是株高20 cm采收时的14.8倍。

注：以株高20 cm为对照。Note: The control was plant height at 20 cm.图2 不同施氮量和采收时期处理下菜薹中维生素C(A)、维生素E(B)、维生素B1和B6(C)相关基因表达量变化Fig.2 The expression amount of genes encoding vitamin C (A), vitamin E (B), vitamin B1, and vitamin B6 (C) under different nitrogen application rates and harvesting heights in young rapeseed stem

3 讨论

本研究表明，AsA含量在4个株高采收时期均随着施氮量的增加而降低。已有研究表明过量氮肥导致植物组织内维生素C含量降低[24-26]。为揭示氮肥降低菜薹维生素C含量的原因，本研究从氮肥施用量和采收时期与维生素C合成关键酶和基因表达的关系角度进行剖析。GalLDH是L-半乳糖途径中催化合成AsA的关键酶之一[27-29]。在株高低于40 cm采收的菜薹中，AsA含量与GalLDH活性总体随着施氮量的增加而降低，说明施氮量的增加减弱了GalLDH活性，使AsA合成受阻。在株高50 cm采收菜薹时，增施氮肥后AsA含量降低与GalLDH活性增加的趋势相反，但与GalLDH表达量降低一致。这可能与GalLDH受多个基因调控有关[30]。本研究从GalLDH调控途径初步明确了施氮量对ASA具有重要的调控作用。

菜薹维生素C含量还受细胞内的氧化和还原代谢调节，该过程涉及多种酶，如AAO、APX等[25-26]。株高20 cm采取时，增加施氮量增强了APX活性，利于AsA氧化为MDHA[6]；同时，施氮量的增加下调了MDHAR的表达量，从而降低了MDHAR活性，导致MDHA不能及时还原成AsA，而是通过歧化反应大量合成DHA，最终促进了DHA含量的积累。株高30 cm以上采收时，施氮量从120增加至180 kg·hm-2时，APX活性降低，MDHAR活性增加，但APX活性可能大于MDHAR；而施氮量从180增至240 kg·hm-2时，APX和MDHAR活性均降低，可能导致AsA和DHA之间的转换减弱。此外，施氮量增加提高了DAHR活性，则可能促进DHA进入谷胱甘肽代谢系统而消耗其含量[6]，导致在施氮量增加时DHA含量降低。从基因表达量看，施氮量调控对AAO、DHAR等基因的调控则与酶活性趋势基本一致。该结果从基因表达层面提供了氮肥调控油菜薹维生素C含量变化的分子证据。

就维生素E含量而言，施氮量从120 kg·hm-2增加至180 kg·hm-2时提高了其含量。在株高20 cm采收时，编码维生素E合成相关基因VTE和HPD受氮肥正向调控，株高50 cm采收时，受氮肥正向调控，其余相关基因则受负向调控。推测VTE、HPD和TPT1基因在这两个采收时期对菜薹维生素E含量积累具有重要作用。当施氮量增至240 kg·hm-2时，油菜薹中的维生素E含量降低，而在该施氮量下，大量维生素E合成相关基因表达量下调，这可能是氮肥施用过量后导致维生素E含量降低的原因。在株高30～40 cm采收的菜薹中氮肥对维生素E合成相关基因的调控作用与其他2个时期正好相反，说明在该阶段采收菜薹时，适量增施氮肥对促进维生素E积累的调控效果较佳。

就菜薹维生素B1而言，在株高30～40 cm采收时，其含量整体随着施氮量的增加而增加。施氮量增加时，THIC和HMPPK均上调。已有研究表明，THIC和HMPPK对维生素B1的积累具有重要的调控作用[31-32]，因此，推测施氮上调了THIC和HMPPK表达量，二者共同促进了维生素B1的积累。油菜薹在株高50 cm采收时，增加施氮量提高了维生素B1含量可能是因为施氮量上调THIC的作用补偿了HMPPK的下调效应。

研究表明，植物PDX1和PDX2基因与维生素B6合成密切相关[33-34]。油菜薹在株高20和40 cm采收时，维生素B6含量随着施氮量的增加先增后减。油菜薹在株高20 cm采收时，PDX1.1在施氮量180 kg·hm-2处理下呈上调，其余基因均为下调。推测施氮量对PDX1.1表达量的上调作用可能是促进维生素B6积累的重要因素。

4 结论

本研究结果表明，施氮量的增加显著降低了AsA含量。在株高20 cm采收的菜薹中，施氮量增加促进了DHA含量，但随着采收株高的进一步增加，施氮量对DHA含量也具有降低效应。菜薹中维生素E、维生素B1和维生素B6含量在施氮量为180 kg·hm-2时最高。就采收时期而言，相同施氮量下，株高30和40 cm采收的菜薹具有较高的维生素含量。因此，综合分析认为，施氮量180 kg·hm-2和株高30～40 cm是采收油菜薹的最适宜施氮量和最佳时机。