HPV18在不同病理类型宫颈癌中miRNA表达差异研究

刘 淼，张晓晓，李瑞珍，叶 静，乌兰娜

(1.北京大学深圳医院妇科，广东 深圳 518036；2. 北京大学深圳医院中心实验室，广东 深圳 518036)

宫颈癌在我国临床具有较高的发病率，其发生与高危型人类乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染有密切的关系，高危型HPV是宫颈癌发生的必要条件，故高危型HPV感染是临床研究重点。宫颈腺癌与宫颈鳞癌的预后存在一定差异[1-2]。另外，有研究显示，HPV18感染可能与宫颈腺癌的发生有关，感染HPV18的宫颈癌前病变进展更快，因此对于HPV18感染宫颈癌患者的miRNA表达差异研究意义较高[3-4]。本研究就HPV18在不同病理类型宫颈癌中miRNA表达差异进行探究，现将结果报告如下。

1 资 料 与 方 法

1.1一般资料 选取2016年7月—2018年6月期间北京大学深圳医院的30例HPV18阳性宫颈腺癌患者为A组，同时期的30例HPV18阳性宫颈鳞癌患者为B组，同时期的15例宫颈正常者为C组。A组年龄29～65岁，平均(46.2±5.0)岁，其中≤45岁者15例，>45岁者15例；分期：Ⅰ～Ⅱ期者13例，Ⅲ～Ⅳ期者17例；分化程度：高分化者11例，中分化者10例，低分化者9例；转移情况：是者13例，否者17例。B组年龄29～65岁，平均(46.5±5.5)岁，其中≤45岁者15例，>45岁者15例；分期：Ⅰ～Ⅱ期者15例，Ⅲ～Ⅳ期者15例；分化程度：高分化者11例，中分化者10例，低分化者9例；转移情况：是者12例，否者18例。C组年龄26～60岁，平均(45.1±5.7)岁，其中≤45岁者8例，>45岁者7例。三组的年龄、A组与B组的分期、分化程度及转移情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：①年龄20～65岁者；②未进行相关治疗者；③对研究知情同意者。排除标准：①进行化疗放疗及其他相关治疗者；②合并其他高危型HPV感染者；③合并慢性基础疾病者；④多系统器官功能不全者；⑤妊娠期及哺乳期者；⑥精神与认知异常者。

本研究经医院医学伦理委员会批准，患者签订知情同意书。

1.2方法 采集A组与B组的病灶组织标本、C组的正常宫颈组织标本送检，标本收集后放-80 ℃保存。随机选取HPV18阳性的宫颈腺癌和鳞癌组织标本各6例以及正常宫颈组织标本6例送往康成生物公司进行miRNA芯片表达检测：样品RNA抽提；RNA质量检测；制备荧光标记探针；芯片杂交图像采集。miRNA芯片检测结果由数据分析员分析,通过芯片中位值对miRNA芯片原始信号值进行标准化，通过标准化后的信号值计算出每个miRNA在不同样品间的表达变化，并计算样品间miRNA表达量变化的统计学显著性。表达变化倍数≥2，P<0.05的miRNA被挑选出来，为显著性差异表达的miRNA。参照TakaRa SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR Kit说明书，将提取的RNA逆转录，将筛查出的差异miRNA进行Real-time PCR反应，由罗氏480Ⅱ荧光定量PCR仪完成。U6作为内参，每个样品设3个复孔。根据同一个样本的CT值(目标基因和内参基因)计算△CT值，miRNA表达相对量采用2-△△CT进行计算比较三组的差异表达miRNA及靶基因的表达情况，并比较A组中不同年龄(45岁及>45岁)、分期(Ⅰ～Ⅱ期及Ⅲ～Ⅳ期)、分化程度(高分化、中分化及低分化)及转移(是与否)情况者的上述差异表达miRNA及靶基因表达情况。

1.3统计学方法 应用SPSS 16.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用t检验、单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1三组的差异表达miRNA及靶基因的表达情况比较 A组与B组的差异表达miRNA为miR-34、miR-19，A组的miR-19及survivin表达显著高于B组，miR-34及PTEN表达显著低于B组，且A组与B组miR-19和survivin表达高于C组，miR-34和PTEN表达低于C组，三组之间的比较结果差异有统计学意义(P<0.001)，见表1。

表1 三组的差异表达miRNA及靶基因的表达情况比较

2.2A组不同年龄者的差异表达miRNA及靶基因的表达情况比较 A组中不同年龄者的miR-34、miR-19、survivin及PTEN表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3A组不同分期者的差异表达miRNA及靶基因的表达情况比较 A组中分期较高者的miR-19及survivin表达显著高于分期较低者，miR-34及PTEN表达则显著低于分期较低者，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

2.4A组中不同分化程度者的差异表达miRNA及靶基因的表达情况比较 A组中分化程度较低者的miR-19及survivin表达显著高于分化程度较高者，miR-34及PTEN表达则显著低于分化程度较高者，不同分化程度患者之间的比较结果差异有统计学意义(P<0.001)，见表4。

2.5A组中不同转移情况者的差异表达miRNA及靶基因的表达情况比较 A组中存在转移者的miR-19及survivin表达显著高于无转移者，miR-34及PTEN表达则显著低于无转移者，差异有统计学意义(P<0.05)，见表5。

表2 A组中不同年龄者的差异表达miRNA及靶基因的表达情况比较

表3 A组中不同分期者的差异表达miRNA及靶基因的表达情况比较

表4 A组中不同分化程度者的差异表达miRNA及靶基因的表达情况比较

表5 A组中不同转移情况者的差异表达miRNA及靶基因的表达情况比较

3 讨 论

宫颈癌作为女性第二大恶性肿瘤，在我国具有较高的发病率，关于本病发生发展的研究众多。对于本病的研究显示，高危型HPV感染几乎是所有宫颈癌发生的必要条件，故高危型HPV感染一直是本病的研究重点[5-6]。研究显示，HPV16感染与宫颈鳞癌的发生密切相关，而HPV18感染倾向于宫颈腺癌的发生，而宫颈腺癌的淋巴和卵巢转移率均相对较高[7-8]，且对放化疗的敏感性相对较低，因此预后较差，病死率也较高，因此对宫颈腺癌的临床发病机制等方面的研究意义更高[9-11]。临床中与宫颈癌相关的miRNA相关研究众多，且在宫颈癌患者中表达显著异常的miRNA指标多见，但是用于宫颈癌病理类型鉴别的miRNA指标研究相对不足，同时，HPV18感染对宫颈癌中miRNA表达差异研究，尤其是对不同病理类型宫颈癌的表达差异研究极为匮乏。对本方面的研究有助于了解HPV18感染病理分型及miRNA表达的检测意义[12-13]，为疾病的诊治与防控提供参考依据。

本研究就HPV18在不同病理类型宫颈癌中miRNA表达差异进行探究，结果显示，HPV18阳性宫颈腺癌患者及HPV18阳性宫颈鳞癌患者的差异表达miRNA为miR-34、miR-19，对上述mRNA及其靶基因的进一步研究显示，HPV18阳性宫颈腺癌患者的miR-19及survivin显著高于HPV18阳性宫颈鳞癌患者，miR-34及PTEN显著低于HPV18阳性宫颈鳞癌患者，且HPV18阳性宫颈腺癌患者与HPV18阳性宫颈鳞癌患者的上述检测结果显著异于健康宫颈者，说明miR-19、miR-34、survivin及PTEN在HPV18阳性在不同病理类型宫颈癌中的表达差异显著，有助于鉴别HPV18阳性宫颈癌患者的病理分型，同时对于HPV18感染导致的miRNA异常表达有一定的反应价值，其通过影响miR-19及miR-34的表达来进一步影响相关靶基因survivin及PTEN等有关[14-16]，survivin及PTEN 作为miR-19及miR-34的作用靶基因，其主要为导致靶基因survivin的过度表达及PTEN的下降缺失，而这可导致细胞周期的阻滞，细胞凋亡抑制情况突出，进而引起癌前病变向宫颈癌的进展，因此在宫颈腺癌的发生发展中起着较大的影响作用[17-19]。另外，对HPV18阳性宫颈腺癌中不同年龄者研究显示，上述指标表达差异并不显著，而不同分期、分化程度及转移情况者的表达差异较为显著，因此提示miR-19、miR-34、survivin及PTEN表达差异有助于HPV18阳性宫颈腺癌的分期、分化程度及转移情况鉴别，因此对于HPV18感染的宫颈癌患者应重视上述指标的检测，同时也为宫颈癌尤其腺癌的基因诊断、靶向药物治疗以及预后评估都提供一定参考价值[20-21]。

综上所述，miR-19、miR-34、survivin及PTEN在HPV18阳性在不同病理类型宫颈癌中的表达差异显著，且不同分期、分化程度及转移情况者的表达情况差异明显，故临床检测与研究意义较高。