双氢青蒿素对人胃癌细胞BGC-823细胞增殖、凋亡的影响及机制研究

徐彦楠，孟 丽，朱 艳，闫 静，王彦玲，周晨明*

(1.河北医科大学教学实验中心，河北 石家庄 050017；2.河北医科大学电镜实验中心，河北 石家庄 050017;3.河北医科大学细胞生物教研室，河北 石家庄 050017)

胃癌是世界上常见的消化道恶性肿瘤之一，对人类的健康造成巨大威胁。其发病率和病死率分别位于世界恶性肿瘤第4位和第2位[1]。目前，在临床上主要通过手术切除病灶来治疗癌症改善病情。但是临床症状对于胃癌早期患者来说并不明显，以至于就诊率很低。并且目前在诊疗过程中缺乏诊断胃癌的生物学指标，导致众多出现临床症状的患者在确诊时已是伴有转移的中晚期胃癌[2]。最佳手术治疗时期已经错过，非手术治疗是唯一缓解病情的方式。目前，放疗与化疗已被广泛应用于中晚期肿瘤的非手术治疗中，但在治疗过程中容易出现不良反应，甚至出现器官衰竭。因此，寻找高效低毒的天然药物至关重要。青蒿素是1971年我国科学家在中草药青蒿中分离出的环状倍半萜类化合物，是一种低毒、高效治疗疟疾的天然药物。青蒿素难溶于水，使其疗效不能充分的发挥，因此合成了抗疟效果强于青蒿素且低毒、安全的青蒿素衍生物——双氢青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)。有研究表明，DHA对宫颈癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、淋巴癌和前列腺癌等肿瘤细胞的生长有明显地抑制作用[3-8]，但是否能抑制人胃癌细胞BGC-823细胞及其作用机制的研究尚未报道。因此，本研究旨在探讨DHA抑制人胃癌细胞BGC-823细胞增殖并促凋亡的作用及作用机制，以期为中药抗肿瘤药物的开发提供依据。

1 材 料 与 方 法

1.1实验材料 人胃癌细胞系BGC-823细胞；DHA购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；噻唑蓝(methylthiazoletetrazolium,MTT)购自美国Pharma Minger公司；兔抗人Bax、Caspase-3、Caspase-8单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；羊抗兔二抗购自康为世纪生物试剂公司；倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司；倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司；二氧化碳培养箱购自美国Formascientific公司；酶标仪购自美国Bio-Rad公司；电泳仪购自比利时Consort公司；超薄切片机UC7购自德国徕卡公司；流式细胞仪购自美国BD公司；透射电子显微镜H-7500购自日本日立公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 BGC-823细胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，置于CO2培养箱中，每周传代2～3次，维持细胞处于对数生长期。

1.2.2MTT法检测DHA对BGC-823细胞的抑制率 取对数生长的BGC-823细胞，弃培养基，用PBS进行清洗，加入0.25%胰酶进行消化，用培养基调成单细胞悬液，接种到96孔板上，置于培养箱中培养过夜，待贴壁后根据分组加入不同浓度的DHA[0(对照组)，0.67，1.34，2.68，5.36，10.72 μmol/L]生长24，48，72 h。定时观察细胞生长情况，每孔加入5 g/L MTT 溶液20 μL/孔，孵育4 h后，弃上清加入150 μL/孔 二甲基亚砜。利用酶标仪以波长490 nm测各孔吸光值(absorbance，A)，根据下列公式计算DHA对BGC-823细胞的抑制率：抑制率(%)=(1-实验组A/对照组A)×100%，并将上述计算结果用82798-IC50软件计算出DHA作用的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

1.2.3流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测凋亡率 实验分组为对照组、1.7 μmol/L组、3.4 μmol/L组、6.8 μmol/L组。在细胞培养瓶中以1×105个/mL的浓度接种5 mL BGC-823细胞，24 h后在对照组加入3 mL培养基，实验组中分别加入3 mL终浓度为1.7、3.4、6.8 μmol/L DHA，之后继续在CO2培养箱中培养48 h，终止培养并收集细胞。细胞经0.04%乙二胺四乙酸消化，离心，收集细胞。用预冷PBS重悬，离心、清洗两次，用体积分数为70%乙醇吹打制成单细胞悬液。上机检测前弃乙醇，用PBS清洗重悬，取单细胞悬液0.1 mL，加入1 mL碘化丙啶染液，将其置于4 ℃冰箱避光继续孵育30 min，以500目铜网过滤，用流式细胞仪进行分析检测凋亡率。

1.2.4DHA对BGC-823细胞凋亡的形态学影响 分组同FCM，每组均做3个复孔，给药方式同FCM，继续培养48 h后离心，弃上清，PBS洗涤，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗涤，DAPI避光孵育3 min，PBS清洗后置于荧光显微镜下观察、拍照。收集细胞，离心成团，弃上清，加入2.5%戊二醛进行前固定、1%四氧化锇后固定1.5 h、经50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脱水、Epon812树脂包埋、超薄切片机切50 nm超薄切片、醋酸双氧铀及柠檬酸铅染色各30 min，在透射电子显微镜下检测、拍照。

1.2.5Western blotting检测相关蛋白表达 细胞分组及处理同FCM，继续孵育48 h后，经预冷的PBS洗涤，用裂解液裂解60 min，测定蛋白质浓度。之后进行蛋白电泳和转膜，再进行免疫反应：将膜用5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，加入兔抗人Bax、Caspase-3、Caspase-8孵育，4 ℃冰箱过夜；TBST洗涤3次后，与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗孵育1 h，TBST洗涤3次，滴加发光液，显影并采用凝胶图像系统分析。

1.3统计学方法 应用SPSS13.0统计软件分析数据。计量资料比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同浓度DHA对BGC-823细胞的增殖活性的影响 不同浓度DHA作用于BGC-823细胞后，其抑制率随药物浓度的增加而增大，且随着时间的延长而增大，具有显著的剂量和时间依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。DHA作用的IC50为3.4 μmol/L。

表1 不同浓度DHA对BGC-823细胞的抑制率比较

2.2FCM检测DHA对BGC-823细胞凋亡的影响 随着DHA药物浓度的增加，凋亡峰愈加明显，并呈现出剂量依赖性。差异有统计学意义(P<0.01)。见表2，图1。

2.3DHA对BGC-823细胞凋亡形态学的影响 荧光显微镜观察细胞凋亡的形态特征，对照组呈现淡蓝色荧光，且分布均匀、形态完整；随着DHA浓度的增加，实验组BGC-823细胞表现为细胞核固缩，蓝色荧光增强，部分细胞核呈现颗粒团状染色质或碎裂成许多球形颗粒物质，见图2。透射电子显微镜观察细胞凋亡的形态特征：对照组细胞器丰富，细胞核染色质分布均匀；1.7 μmol/L组细胞轻度固缩，染色质电子密度增加，边集于核膜下；3.4 μmol/L组细胞固缩加重，核膜下染色质边集进一步增厚；6.8 μmol/L组细胞体积明显缩小，胞质高度浓缩，染色质边集更加明显，见图3。

表2 FCM检测不同浓度DHA作用48 h后BGC-823细胞凋亡率比较

2.4DHA对BGC-823细胞凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-8的影响 Western blotting结果表明，BGC-823细胞随着DHA用药浓度的增大，Bax、Caspase-3、Caspase-8条带变宽、变深。细胞中Bax、Caspase-3、Caspase-8蛋白表达随着DHA给药浓度的增加而增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3，图4。

表3 不同浓度DHA及对照组作用48 h后BGC-823细胞Bax 、Caspase-3、Caspase-8蛋白表达

Figure 3 BGC-823 cells morphology using transmission electron microscope

3 讨 论

我国每年新增的胃癌患者约为67.9万，死亡约为49.8万，占全球总人数的45%[9]。虽然近些年，通过改善饮食习惯、降低危险因素等方法，胃癌发病率逐年降低，但仍是常见的恶性肿瘤之一。抑制肿瘤生长是目前临床治疗肿瘤的重要途径。DHA是青蒿素的主要衍生物，对多种组织的人类恶性肿瘤具有明显的细胞毒性作用[3-8]。为了考察DHA抗胃癌的作用和机制，本研究采用人胃癌细胞BGC-823细胞探讨DHA抗胃癌的效果及机制。本实验通过MTT检测DHA对人胃癌细胞BGC-823细胞增殖活性的影响，结果显示DHA对BGC-823细胞增殖的抑制作用明显且具有时间和剂量依赖性。

在MTT检测过程中，通过倒置显微镜可见用药组细胞凋亡现象明显。细胞凋亡是一个高度调控的细胞死亡过程，主要负责清除那些已经高度损坏、被破坏、老化和不可修复的细胞，以维持多细胞生物的正常生理过程。细胞凋亡出现异常可以导致和促进多种疾病如：自身免疫性疾病、神经退行性疾病、心脏病和癌症等的发生[10-12]。因此，涉及细胞凋亡调控的因素对疾病的诊断和干预有着巨大的价值。本实验通过 FCM检测发现随着DHA给药浓度的升高，细胞凋亡率也随之升高，表现为明显浓度依赖性。进一步通过荧光显微镜及透射电子显微镜观察，发现用药组细胞随着给药浓度的升高，细胞凋亡形态的变化更加明显，与FCM结果一致。

Caspases是属于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的一类蛋白质，在凋亡的过程中发挥着重要的作用[13]。内源性和外源性凋亡都依赖于Caspases家族成员的激活。在细胞凋亡之前，细胞的表面受体会传递一种来自细胞外微环境的死亡信号，“死亡”配体与其受体结合，形成诱导死亡的信号复合体，然后激活Caspase-8，进一步激活Caspase-3，从而引发细胞凋亡[14]。Caspase-8主要位于线粒体，少数位于胞质和胞核中，其介导TNFR1等死亡受体诱导的细胞凋亡，是凋亡途径关键的启动者[15]。Caspase-3是整个凋亡通路的中枢，是Caspase凋亡级联通路的效应体，Caspase-3在启动外部凋亡通路和内部凋亡通路后均被激活，其作为细胞凋亡的执行者，通过特异性地裂解底物最终导致细胞凋亡[16]。Bax 又称成孔蛋白，是Bcl-2家族中经典的促凋亡因子，在调节细胞凋亡中发挥着重要的作用[17]。它可以在线粒体外膜上形成孔，导致线粒体的破坏并使细胞色素C释放增加，与Apaf-1相互作用，导致Caspase-9的激活，引起Caspases 的级联反应，最终导致细胞凋亡[18]。有研究表明，Bax、Caspase-3、Caspases-8基因的激活促进细胞凋亡[19]。本实验通过Western blotting测定Bax、Caspase-3、Caspase-8基因表达，结果显示其表达量用药组高于对照组，提示DHA可以使Bax、Caspase-3、Caspase-8的表达增加，进而诱导细胞凋亡。

由此可见，DHA对BGC-823细胞的增殖具有明显的抑制作用，其诱导凋亡的机制可能是通过上调Bax、Caspase-3、Caspases-8的表达而起作用，但DHA诱导凋亡信号通路的具体分子机制有待进一步研究。