基于表型性状的春兰种质遗传多样性分析

傅巧娟，李春楠，张晓莹，赵福康

（杭州市农业科学研究院，杭州 310024）

0 引言

春兰(Cymbidium goeringii)又名草兰、山兰或朵朵香，为兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)多年生草本地生植物，其味清幽，花色淡雅，具有很高的观赏和经济价值。广泛分布在中国南方各省，日本与朝鲜半岛南端也有分布。春兰是栽培历史最为悠久、分布最广、资源最丰富、选育园艺栽培品种最多的兰花之一[1]，也是人们最为喜欢的种类之一。

种质资源是遗传研究与育种应用的基础，如何科学有效地评价种质资源的遗传多样性和遗传关系也是资源鉴定、保护、品种改良等工作的重要内容[2]。运用形态学性状检测遗传变异是最古老和简便易行的方法，也是植物学分类的主要依据之一[3]。利用植物的表型性状研究其遗传多样性已被广泛应用于番茄[4]、萝卜[5]、柑橘[6]、梨[7]、狼尾草[8]、红花[9]、芍药[10]、一串红[11]等多种园艺植物中。近年来，张韶伊等[12]、陈君梅等[13]对部分春兰种质进行了形态多样性研究，但所涉及的种质及检测的性状较少。笔者以120份春兰种质为材料，从50 个表型性状研究分析其遗传多样性，以期为春兰的资源鉴定、保护及利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试的春兰种质共120份（表1），每份10株以上，分别来自浙江、安徽、福建、江苏、广东等地，统一种植于杭州市农业科学研究院种质资源圃2年以上，统一管理。

1.2 试验方法

1.2.1 数据采集每份种质在连续2年的开花期，选3株以上植株，参考农业部农业行业标准《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南春兰》（以下简称《测试指南》），选取50个表型性状（包括38个质量性状和12个数量性状）进行数据采集。

表1 春兰种质及来源

质量性状包括植株叶姿、大小，叶形、叶片扭曲、叶艺、叶色，开花期，花梗花青甙显色、子房着生处苞片颜色、苞片斑点及条纹，花主色，花被片数，萼片及花瓣姿态，萼片颜色数量、主色、边缘色、斑点、条纹、中萼外卷程度、侧萼边缘卷曲度，花瓣着生状态、唇瓣化、颜色数量、主色、边缘色、斑点、条纹，唇瓣主色、边缘色、斑点、条纹及外卷程度，蕊柱数量、中部色、顶部色、斑点及药帽颜色等，以《测试指南》为标准，通过目测获得。

数量性状包括叶片数、叶长、叶宽，花梗长，花朵、中萼片、侧萼片、唇瓣等的长和宽，中萼片宽长比等，采用直尺测量，测量值保留1位小数。

1.2.2 数据处理 采集的数据均在Microsoft Office Excel 2007 中进行整理，分别计算各种质数量性状的平均值(M)、最大值(Max)、最小值(Min)、极差(R)、标准差(S)和变异系数(CV)，并对各性状进行9～10级分类，1级＜M-2S，10 级≥M+2S，中间每级差0.5S（M为群体性状平均值，S为标准差），利用IBM SPSS Statistics 21软件中非参数检验Kolmogorov-Smirnov(K-S)法检验各性状是否遵从正态分布。对符合正态分布的性状，依据刘孟军[14]概率分级法，用M-1.2818S、M-0.5246S、M+0.5246S、M+1.2818S 4 个分点分为5 级，使1～5 级的出现概率分别为10%、20%、40%、20%和10%；用M-0.5246S、M+0.5246S 2 个分点分为3 级，使1～3 级的出现概率分别为30%、40%、30%。对于不符合正态分布的性状，根据《测试指南》各性状分级数，按照其数据的实际分布情况进行分级[15]。

质量性状依据《测试指南》进行量化，其中颜色性状从浅到深记为1～9。采用Shannon-Weaver多样性指数[式(1)]分析种质多样性[16-18]。

式中，Pi为某性状第i级出现的频率。

1.2.3 主成分分析及聚类分析 运用IBM SPSS Statistics 21 软件进行主成分分析和系统聚类分析，绘制树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 质量性状多样性

2.1.1 有序多态性状多样性分析表2显示的是有序多态性状多样性，可以看到，26 个质量性状Shannon-Weaver多样性指数(I)在0.13～1.69之间。I值最高的为蕊柱中部主色，其次是子房着生处苞片颜色1.65；相关颜色的性状I值均较高，多样性更丰富。I值最低的是花瓣着生状态，其次是萼片颜色数量0.24。

2.1.2 二元性状分布表3显示的春兰12个质量性状均表现为2 种形式，即“有”或“无”。可以看到，参试的120 份材料唇瓣均无条纹；叶片无扭曲、无叶艺、萼片无斑点占87%以上，而花梗花青甙显色、唇瓣斑点以“有”居多，占85%以上；其他5个性状2种表现形式均占较高比例，多样性更为丰富。

2.2 春兰数量性状变异分析

群体数量性状的差异性和多样性常用变异系数(CV)来反映，变异系数大则分化程度高、多样性显著，相反则群体相对稳定、一致性较高。120 份春兰种质数量性状的变异情况见表4。总体上看，各性状的CV值均在13%以上，变异程度较高；其中CV值最低的为叶片数(13.5%)，说明该性状在各种质间相对稳定；其次是唇瓣长、唇瓣宽，分别为18.3%、20.4%；CV值最高的为花梗长(48.8%)，多样性丰富。

表2 春兰质量性状Shannon-Weaver多样性指数比较

表3 二元性状分布比例 %

2.3 数量性状的分布规律及分级

K-S检验结果（表5）显示，中萼片宽长比和侧萼片宽的Sig.值大于0.05，符合正态分布，按1.2.2 进行分级；其余11个性状Sig.值均小于或等于0.05，不符合正态分布。对11个非正态分布性状，按照实际测量结果的10%、20%、40%、20%、10%或30%、40%、30%的比例进行5级或3级的分级，确定分点值，将数量性状进行统一化和规范化的描述[15]。

2.4 主成分分析

从检测的51个表型性状指标中，选取变异较大（I值或CV值较高，二元性状分布分散）的41 个指标（表6）进行主成分分析，按照特征值大于1的原则，提取前13 个主成分，累计贡献率达到71.301%。第一主成分的特征值6.066，方差贡献率最大14.795%，占主导地位；特征向量绝对值较大的性状有中萼片长、中萼片宽、中萼片宽长比、侧萼片长、侧萼片宽、花朵宽、花朵长等，其中中萼片宽、中萼片宽长比、侧萼片宽为负值，说明它们与其余4 个性状之间呈负相关，决定了春兰花朵的大小及形状，为花朵大小因子和花型因子。第二、第三和第四主成分的特征值分别为4.853、2.667、2.309，方差贡献率11.837%、6.505%、5.632%，主要由唇瓣长、唇瓣宽、花主色、萼片中部主色、花瓣中部主色、花瓣边缘色、蕊柱顶部色、唇瓣外卷程度、花瓣斑点、花瓣条纹、花梗花青甙显色等性状决定，为花色因子、唇瓣因子。第六主成分开始主要由植株大小、花梗长、叶长、叶宽、叶片数等性状起决定作用，称为株型因子、叶形因子。6 个因子可视为春兰种质评价与杂交育种中亲本选择的主要表型指标。

表4 春兰数量性状变异分析

表5 数量性状K-S正态性检验及概率分级分点值

2.5 聚类分析

采用欧式距离(Euclidean distance)、Word 法对120份种质进行系统聚类，得到树型聚类图（图1）。可以看到，在欧氏距离为18.1处可将群体分为2大类，第一大类(Ⅰ)包含24 份种质，主要以素心为主，唇瓣较小（表7）；另外96 份种质聚为第二大类。在欧氏距离为9.2 处，第二大类又分为3 个亚类：第一亚类以奇花型为主(Ⅱ)，叶片狭长，花大，但萼片较小，共11 份种质；第二亚类(Ⅲ)38 份种质，包含一些色花、蝶花等种质；其余47 份种质聚为第三亚类(Ⅳ)，表现为萼片较短、宽，且基本无条纹。从聚类情况还可以看到，花朵大小、花色、唇瓣色相近的首先聚在一起，如第一大类(Ⅰ)以素心（花朵黄绿色，无斑点、条纹）为主；大元宝和大品蝶均为蝶花；银边春兰、金边春兰、雪山和双娇均为覆轮复色花；冠豸彩球与DFQ、盛世牡丹与GCQQ 等均为奇花等；Ⅱ类花朵较大；Ⅳ类花朵较小、萼片较宽。与主成分分析结果一致。

表6 入选主成分的特征值、贡献率及特征向量

续表6

3 结论

笔者从50 个表型性状入手，研究分析120 份春兰种质遗传多样性，发现春兰表型多样性极为丰富，无论是质量性状还是数量性状，都表现出极为丰富的多样性，与张韶伊等[12]、陈君梅等[13]的研究结果一致。其中颜色性状Shannon-Weaver多样性指数(I)较高，花梗长CV值最高，多样性更丰富，与陈君梅等[13]的研究结果一致；叶片数变异相对稳定，数量性状的分布规律多数不符合正态分布，可能与种质来源及人工选择栽培有关。

主成分分析结果显示，提取的前13个主成分6个因子综合反映了春兰的表型，但其累积贡献率只有71.301%，说明各性状贡献率较为分散，累积贡献率增长不明显，也表明性状变异具有多向性。聚类分析发现，花朵大小、花色、唇瓣色相近的首先聚在一起，与主成分分析结果相符；但与传统春兰品种按瓣形进行区分的结果不尽一致，王晓英等[1]和牛田等[19]的试验结果也认为，聚类结果与春兰的瓣形分类是不一致的，这可能与春兰种质的人为选择及多样性有关，因此，分类标准有待进一步研究。此外，季祥彪等[20]研究表明，野生春兰样品的聚类具有很强的地域性；牛田等[19]研究认为，来自于相同地区的春兰品种的亲缘关系较近，与本试验结果不完全一致，可能与春兰在不同地区间交流引种增多有关，也可能与选择分析的表型性状有关，这些将在今后的研究工作中进一步完善。

表7 4个类群13个数量性状指标比较

4 讨论

种质资源遗传多样性的丰富程度对品种改良、新品种选育有着直接作用。了解春兰的遗传多样性水平，对解析其遗传与进化，理解人为或生态变迁的影响力具有极大的参考价值，也是未来遗传变异的起点和遗传改良的前提[1]。随着分子生物学技术的不断发展，DNA分子标记技术已经逐渐应用到春兰的遗传多样性分析及鉴定中，目前应用于春兰的分子标记主要为SRAP[19]、RAPD[20]、AFLP[1,21]及ISSR[22-23]等。同工酶技术也应用于春兰品种间的亲缘关系分析[24]。而表型性状是植物生长的最直观表现，受植物本身基因型和环境因素的综合作用，表现出稳定性和变异性共存的特点[25]，长期以来，植物种质资源的分类、鉴定及育种材料的选择通常是依据表型性状来开展的[26-28]。当然，将表型分析与其他手段或技术结合研究种质遗传多样性，将更有助于资源的合理评价、鉴定、开发和利用。