王 月,刘子航,吴珊珊,别福鑫,张 丽
(1.牡丹江医学院研究生院;2.牡丹江医学院附属红旗医院呼吸与危重症医学科,黑龙江 牡丹江 157011)
曲霉菌病在临床中以各种形式存在,世界范围内的曲霉菌病患病率约为800万,其中慢性肺曲霉菌病(chronic pulmonary aspergillus,CPA)达300万。CPA的5年生存率估计为50%,与特发性肺纤维化相似[1]。据估计全世界300万CPA患者中,五年死亡率高达85%[2],被认为是最难治的肺部感染性疾病之一。不能及时的对疾病做出正确诊断是导致CPA病死率高的原因之一。所以早期快速诊断对疾病有重要作用,可及时控制病情,改善预后,对曲霉病的诊断提出了许多挑战。CPA诊断基于慢性症状,放射学变化和实验室检查[2-4]。不幸的是,咳嗽和呼吸困难等症状没有特异性,可能与潜在的其他肺部疾病重叠。而影像学上的空洞、纤维化和胸膜增厚等改变也可能与其他肺部疾病重叠,仅在少数病人检查出特有曲菌球[3-5],因此实验室检查至关重要。
传统的真菌实验室诊断主要包括临床样本的直接显微镜检查、组织病理学检查和真菌培养的方法。显微镜检查灵敏度因标本的来源和质量以及检验师的技能和经验而异。组织病理学检查可能需要使用深部组织的活组织检查,易对患者构成风险。真菌培养可能有所帮助,但培养对曲霉菌病诊断的敏感性较低。灵敏、特异、快速的诊断方法已成为CPA研究领域的热点。随着检测水平的不断提高,目前不同于传统检测方法的血清学检测技术已经在CPA检测领域发挥非常重要的作用。血清学是一种微创样本,不受患者病情和身体状况的限制。血清学的诊断主要包括抗原、抗体检测两类。抗原检测为1,3-β-D-葡聚糖检测和半乳甘露聚糖检测。抗体检测主要有:曲霉IgA、IgE、IgG、IgM抗体。
2.1 1,3-β-D-葡聚糖检测(G实验)1,3-β-D-葡聚糖(1,3-β-D-glucan,BG)是曲霉菌细胞壁的多糖组分,G实验检测的是BG,吞噬细胞吞噬真菌后,能持续释放BG入血。G实验适用于大多数深部真菌感染的早期诊断,尤其是念珠菌和曲霉菌,但不能确定菌种和菌属。因此G实验为阳性时无法确诊是否为肺曲霉菌感染。G实验有其局限性,以下情况可出现假阳性:(1)使用纤维素膜进行血透;(2)食用菌类食物可以导致假阳性[6];(3)静脉输注免疫球蛋白、清蛋白、凝血因子或血液制品;(4)测试材料含葡聚糖。
2.2 半乳甘露聚糖检测(GM实验)半乳甘露聚糖(galactomannan,GM)最初是在感染免疫抑制的兔血清中被发现的烟曲霉抗原,是一种存在于大多数曲霉属细胞壁中的多糖,广泛分布于曲霉菌细胞壁中。曲霉菌生长时半乳甘露聚糖从薄弱的菌丝顶端释放,当这些成分进入人体血液或深部组织、被吞噬细胞吞噬消化后,半乳甘露聚糖从细胞壁被释放。因此,对GM检测是曲霉菌感染的敏感指标[7-8]。GM检测目前广泛用于粒细胞缺乏的侵袭性曲霉菌病的诊断,在感染的早期阶段,抗原可能存在于血清或其他可以检测GM的其他体液中,反复进行抗原检测可以为机会性真菌病提供可靠依据。但GM检测在CPA中诊断价值有限。有研究认为仅25%左右的CPA 患者呈阳性[5,9]。GM检测的样本有脑脊液、血清、支气管灌洗液。近年对肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中GM的检测也逐渐增多,多数临床研究认为 BALF-GM 对肺曲霉病诊断的优于血清。杨淑乔[10]等对BALF-GM肺曲霉病的诊断作出研究,BALF-GM临界值为0.5时对肺曲霉病诊断率为0.813。当然GM也有其局限性,GM假阳性的因素有:(1)使用β-内酰胺类、碳青霉烯类、喹诺酮类等抗生素[11];(2)肾脏疾病导致肾清除率降低;(3)做GM检测前食用牛奶等高蛋白食物或受污染的大米。GM假阴性的原因:通常与服用抗真菌药物有关。
鉴于抗原检测灵敏度、特异度低,所以对于CPA的诊断价值不大[12]。迄今为止,检测到抗曲霉菌抗体被认为是最可靠的方法,过去对曲霉抗体检测的研究较少,随着近年来CPA患病率日益增多,且诊断率不高,研究人员越来越关注曲霉抗体检测在CPA诊断的作用。真菌抗体血清学检测已在国外临床检验领域有较广泛的应用,但在国内对真菌抗体血清学检测对慢性肺曲霉菌病诊断价值相关报道甚少。
3.1 曲霉IgM抗体曲霉菌在生长周期的不同阶段产生许多不同的抗原,这些抗原以不同的方式与免疫系统相互作用[13],IgM可与不同的曲霉属抗原的组合。随着时间的推移,IgM可能被反复再刺激,在CPA中曲霉IgM抗体可升高。但IgM抗体可针对多种曲霉抗原,可以在一段时间内保持阳性。因此,曲霉IgM抗体检测特异性差,限制了其效用。2019年郭益群等人[14]研究中得出曲霉菌IgM抗体在CPA定植和其他肺病组中具有统计学意义,但该标志物的敏感性和特异性受到限制。此外,与单次使用曲霉特异性IgG测试相比,曲霉IgG和IgM测试的组合在CPA的诊断方面没有表现出优势。想确定曲霉IgM具有曲霉菌IgG不具有的早期诊断价值,需要进行更多高质量,大样本的研究以进一步验证。目前认为曲霉菌特异性IgM对CPA的诊断价值有限。
3.2 曲霉IgA抗体这种免疫球蛋白类型通常与粘膜免疫有关,并且随着粘膜不断暴露于真菌生长,它可能持续升高。曲霉IgA抗体同IgM抗体因其特异性差,在CPA中诊断作用不大。
3.3 曲霉IgE抗体曲霉IgE抗体滴度为阳性时对CPA临床诊断有一定的诊断价值。偶尔,具有CPA症状和或放射学变化的患者,但是曲霉菌特异性IgG水平正常,曲霉菌特异性IgA、IgE测试可能存在一定的诊断价值。
3.4 曲霉IgG抗体2015年欧洲呼吸学会和欧洲临床微生物与感染学会发布首个慢性肺曲霉病诊断与治疗指南[15],提到曲霉特异性IgA、IgE、IgM、IgG抗体检测在CPA诊断均有作用,但曲霉菌IgG抗体的检测灵敏度及特异度更高,因此对曲霉IgG抗体的血清检测被认为是诊断CPA最可靠的方法[16]。2016年美国感染病学会关于曲霉病诊断与处置指南中,特别强调了曲霉IgG抗体检测是慢性空洞性肺曲霉病诊断中灵敏度最高的诊断方法[17]。对于由烟曲霉引起的慢性肺曲霉病,IgG检测具有90%~95%的敏感性,甚至优于高容量培养技术。当然,曲霉IgG抗体检测对于急性侵袭性肺曲霉菌病中抗体检测阳性率较低,因为免疫抑制会导致抗体反应延迟或缺失。目前,曲霉IgG抗体对CPA的诊断价值在国外已经被广泛的研究,特别是日本,已经用于CPA的诊断,在中国曲霉IgG抗体对CPA的研究相关报道甚少。2019年国内首例对曲霉菌IgG检测对CPA的诊断作出研究,郭益群等人[14]在研究中得出,曲霉菌特异性IgG水平显着高于其他肺病组中测定的水平。曲霉IgG抗体在CPA阳性率为76.2%。数据表明了曲霉菌IgG抗体对中国人CPA的诊断价值,进一步为中国患者的曲霉特异性IgG诊断标准提供了有价值的见解。研究也得出了曲霉菌IgG抗体可区分CPA与其他肺部疾病,对CPA具有重要的诊断价值。此外,曲霉菌特异性IgG对感染和定植鉴定的诊断价值非常宝贵。随后,杨淑乔[10]等对肺曲霉菌病患者(侵袭性肺曲霉菌病和CPA)的研究,得出140 kAU/L为临界值时,曲霉 IgG抗体的阳性率为77%。
4.1 抗原检测技术检测GM的方法包括酶免疫测定(enzyme immunoassay,EIA)、放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)和乳胶凝集法 (latex agglutination,LA),其中以EIA敏感性最高。EIA最初仅针对血清标准化,后来针对BALF标准化。由于肺部最常受到曲霉病的影响,因此在中BALF检测GM已经占据了显著位置。BALF中的GM对非血液病患者(慢性阻塞性肺疾病、重症监护病房等患者)具有高灵敏度和特异性。EIA在全世界被用于GM检测,此检测方法根据不同厂家的试剂盒有不同的阳性指数(IP)。国内外对于GM 检测阳性临界值的选择仍无统一标准。日本学者一项研究提到,在CPA 患者中cut-off = 0.5时阳性率较高。
4.2 抗体检测技术目前有许多检测曲霉属特异性抗体的方法,但对这些检测方法均在资源充足的医疗环境中进行的。虽然高收入的国家诊断率高,但据统计,患病率比较高的为中低收入的国家。由于曲霉菌易好发于肺结核患者中,大多数由肺曲霉菌引起的慢性病例发生于资源匮乏或医疗水平有限的地区,所以简单、易行以及不需昂贵的设备和专业技术人员的检测技术对CPA患者治疗及预后起着至关重要的作用。在过去的50年中已经开发了许多曲霉抗体检测系统,可用的技术包括免疫扩散(Immunodiffusion,ID),免疫电泳(Immunoelectrophoresis,IEP),补体结合(Complement bindingCF)和酶联免疫测定(enzyme linked immunoassay,EIASA)。CF相当耗费人力,并依赖于人类对结果的解释,故很少应用。ID技术已经普遍使用超过70年。在技术娴熟的人手中,它可能是一项有用的测试,但该技术非常耗时,实验室之间的标准化和复制极具挑战性,目前已被ELISA取代[18-19]。因为IEP、ID其灵敏度相似,但IEP检测所需的时间短,IEP在很大程度上取代了ID。法国医学真菌学会专家委员会对于曲霉菌血清学的检验技术报道,认为曲霉ELISA和IEP分别是最常用的诊断技术。但研究中也提到,IEP有一定的局限性,包括敏感性差,主观定性结果和劳动强度大。用于检测曲霉菌免疫球蛋白类的ELISA检测最初开发于20世纪80年代。在过去十年中,已经开发出几种商业曲霉菌 ELISA,现在广泛用于CPA诊断。商业 ELISA具有完全自动化和结果定量的优势,目前有许多商业产品可供使用,并提供了关于曲霉属宿主抗体反应的大量信息。这种技术允许检测各种类型的抗体。该检测技术可以完全自动化,从而降低人工成本,并可在两小时内出结果,检测阳性率较高。据报道,商业ELISA的灵敏度和特异性分别为75%至98%和84%至99%。制造商提供参考值以区分升高的水平与正常水平。最佳临界值的鉴定对于曲霉属ELISA测定是至关重要的。抗曲霉抗体的ELISA结果高于健康个体的水平则定义为异常[18]。由于慢性疾病中的抗体水平可能远高于过敏性或急性侵袭性疾病,因此临界值可能无法针对CPA进行优化。
综上所述,血清学检测中G实验适用于大多数真菌感染的早期阶段,但不能确定菌种和菌属。GM实验是肺曲霉菌感染的敏感指标,但在CPA患者中阳性率低。所以,曲霉IgG抗体对CPA的检测是最可靠的方法。由于大多数肺曲霉菌病患者生活在资源匮乏的环境中,需要一种适合在这种情况下广泛使用的检测方法。商业ELISA检测技术可以完全自动化,敏度性、特异性、阳性率高,值得推广使用。