双歧杆菌分离株的耐药性评价

潘 琳 郭慧玲 李丽娜 张文羿 陈永福 孟和毕力格

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 农业部奶制品加工重点实验室呼和浩特010018）

双歧杆菌是一种重要的肠道微生物，可用作益生菌应用于食物、医药和饲料中。双歧杆菌存在于人类体内、动物体内以及食物中。人类和动物的肠道健康与否都会受到双歧杆菌的影响[1]。婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）和长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）被广泛用于食物补充剂中。在人与动物预防性使用抗生素的过程中，导致全球的抗生素耐药性危机[2]。一些有利于人类健康和畜牧业的细菌类群也产生了抗生素耐药性。耐药基因可在相同或者不同类群的细菌之间转移，耐药性评估是食品和饲料中使用的细菌安全性评估的一部分[3]。在用抗生素治疗后，可使用固有抗生素耐药性的菌株来恢复肠道菌群的平衡[4]。然而，双歧杆菌的耐药基因有可能通过移动元件转移到病原体。通过双歧杆菌的耐药表型和基因型分析可以确定耐药基因的转移潜力[5]。本研究中，评估来自不同来源的20 株双歧杆菌分离株的耐药性，并确定它们是否具有将耐药基因转移到其它细菌的能力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验菌株 本试验用菌株见表1，均由内蒙古农业大学乳酸菌菌种保藏库（LABCC）提供。

1.1.2 试剂 抗生素：氨苄西林（Amp）、庆大霉素（Gen）、卡那霉素（Kan）、链霉素（Str）、新霉素（Neo）、克林霉素（Cli）、利奈唑胺（Lin）、万古霉素（Van）、奎奴普丁/达福普汀（Qui）、四环素（Tet）、利福霉素（Rif）、环丙沙星（Cip）、甲氧苄啶（Tri）、红霉素（Ery）及氯霉素（Chl），均购自美国Sigma 公司。

试剂：所用引物，上海桑尼生物有限公司合成；DNA 提取试剂盒（天根），10×EasyTaq 缓冲液，dNTPs，EasyTaq 酶，10×TBE 缓冲液，核酸染料。

培养基：标准药敏检测肉汤培养基，Iso-Sensitest，Oxoid；MRS 肉汤培养基，Oxoid；TPY 液体培养基，青岛海博；LSM 液体培养基（90% Iso-Sensitest 肉汤培养基+10% MRS 肉汤培养基）。

1.2 方法

1.2.1 抗生素的配制及菌悬液的制备 15 种抗生素（10 种水溶性，5 种水不溶性）的最小抑菌浓度测定详见参考文献[6]。采用双歧杆菌药敏试验的标准溶剂和最终抗生素浓度[7]。采用LSM-cys（LSM+0.03%半胱氨酸盐酸盐）液体培养基作为药敏试验稀释剂[6]。

表1 本试验用双歧杆菌分离株Table 1 Isolates of Bifidobacterium species used in this study

双歧杆菌分离株划线培养在含1.5%琼脂的TPY 培养基，37 °C 培养在Whitley DG250 厌氧工作站（5% CO2，10% H2，and 85% N2）48 h。在0.85%的生理盐水中挑取单个菌落并悬浮在生理盐水中。采用紫外分光光度计测定波长625 nm 处的光密度OD625nm，通过加入生理盐水调整稀释比，使OD625nm值达到0.16～0.2（3×108CFU/mL）。

1.2.2 最小抑菌浓度的测定 20 株双歧杆菌分离株采用肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），测定标准详见美国临床和实验室标准[7]。将细菌悬浮液稀释500 倍和100 倍，分别用于测定水溶性抗生素和不溶性抗生素的耐药性。对于水溶性抗生素，将1 mL 菌悬液与1 mL 抗生素相混合。对于水不溶性抗生素，将0.2 mL 菌悬液与1.8 mL 抗生素相混合。分别以不添加菌悬液和不添加抗生素的空白作为对照。对每组浓度的抗生素浓度做3 个重复。厌氧培养48 h，记录MIC 值。MIC 值等于或小于临界值定义为敏感（S）；MIC 值高于临界值定义为抗性（R）[8]。MIC 值≥8 μg/mL 和＞32 μg/mL 定义为中等抗性（MR）[9]。选取ATCC15707 作为质控菌，检测试验的准确性。

1.2.3 耐药基因的检测 用DNA 提取试剂盒提取双歧杆菌分离株的基因组DNA，将其作为模板，根据表2中不同耐药性基因的引物进行扩增。每个PCR 反应（20 μL）由DNA 模板、引物、10×EasyTaq 缓冲液、dNTPs、酶和ddH2O 组成。扩增条件是：预变性4 min；30 个循环：变性94°C 30 s，退火30 s，延伸72 °C 1 min；末端延伸72 °C 7 min。PCR 产物由1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表2 PCR 检测用特异性引物Table 2 Specific primers used in the PCR detection

（续表2）

1.2.4 抗生素耐药基因转移试验 以双歧杆菌为供体，乳酸乳球菌MG1614 和粪肠球菌181 为受体，通过滤膜杂交试验评价双歧杆菌种耐药基因的转移情况[10-11]。供体双歧杆菌在添加有红霉素（5 μg/mL）或四环素（10 μg/mL）的TPY 培养基中37°C 厌氧培养。受体菌株乳酸乳球菌MG1614 和粪肠球菌181 在不含抗生素的GM17 和BHI 培养基中分别于30°C 和37°C 培养。以2%的接种量分别接种到不含抗生素的新鲜MRS 和M17 培养基中，培养至OD600nm值为0.2～0.5。分别取供体菌株和受体菌株1 mL，混合后使用压力为-50 kPa的泵将混合液通过滤膜 （直径2.5 cm，孔径0.45 μm）。再次使用PPS 溶液（0.8%NaCl 和中性细菌蛋白胨） 通过滤膜，确保细菌紧密地贴合在滤膜上。将滤膜无菌置于适合受体生长的环境中过夜培养。培养后将滤膜置于2 mL PPS 中，用1 mL PPS 冲洗平板，并再次将洗涤液与原始滤膜置于无菌管中。将无菌管涡旋震荡后，除去滤膜上所有细胞，10 倍稀释溶液后将供体、受体和转化结合子培养在选择性培养基平板中，将平板在37℃或30 ℃培养48 h，每组试验3 个重复。

2 结果与分析

2.1 最小抑菌浓度

20 株双歧杆菌分离株的MIC 值见表3。

20 株双歧杆菌的MIC 值分布集中在2～128 μg/mL 范围，见图1。所有分离株都表现出相似的抗生素敏感性。例如，所有分离株对卡那霉素都有耐药性 （MIC 64～1024 μg/mL），而对氨苄西林（0.032～2 μg/mL）、庆大霉素（2～64 μg/mL）、链霉素（2～128 μg/mL）和利奈唑胺（0.125～4 μg/mL）敏感。各分离株对氯霉素、环丙沙星、克林霉素、红霉素、四环素、甲氧苄啶、奎奴普丁/达福普汀、利福平、新霉素和万古霉素的敏感性存在多样化。菌株IMAUFB113 对卡那霉素的MIC 值为256 μg/mL，而对氨苄西林的最低MIC 值却只有0.0625 μg/mL；菌株IMAUFB271 和IMAUFB272 同属于假长双歧杆菌球旋虫亚种，却对新霉素的敏感程度不同。同样，菌株IMAUFB102，IMAUFB103，IMAUFB104，IMAUFB105，IMAUFB106 及DSM-10140同属于动物双歧杆菌乳酸亚种，也对环丙沙星、四环素、甲氧苄啶及红霉素表现出不同的敏感及抗性程度。

[12]Chl[12]Ery[9]Tri 4S＜0.125S 0.0625S 1S 1R＜0.125S 1S 0.125S＜0.125S 4S 0.0625S＞64R 1S 1R 1S 2S 0.125S＜0.125S 32R＞8R＞64R 32R＞8R 32R 64R＞8R 32R 64R 2R 64R 32R＞8R 32R 2S 0.125S 64R 16R＞8R 64R 4S 8R 32R 2S＞8R 32R 32R＞8R 32R 64R 8R 64R 1S 4R 16MR 0.5S 0.032S 32R 0.5S 0.125S 32R[9]2S[9]ND[9]16MR普奴v；Qui：奎素霉古；Van：万胺）（μg/mL值MIC的株离分菌杆歧双株20 3表）（μg/mL The MIC values for the 20 Bifidobacterium isolates Table 3 [9]Cip[9]Rif[12]Tet[9]Qui[12]Van[9]Lin[12]Cli[9]Neo[12]Str[12]Kan[12]Gen[12]Amp素生抗株离分8MR 0.25S 16R 1S 0.5S 1S＜0.032S 32R 64S 256R 64S 0.25S IMAUFB102 4S 0.25S 8S 0.25S＜0.25S 1S＜0.032S 32R 128S 256R 64S 0.25S IMAUFB103 4S 0.25S 16R 0.25S 0.5S 0.5S＜0.032S 32R 32S 256R 32S 0.25S IMAUFB104 32R 1S 8S 4S 1S 2S 0.125S 32R 16S 128R 16S 1S IMAUFB105 4S 0.25S 8S 0.5S＜0.25S 1S＜0.032S 16MR 32S 128R 16S 0.125S IMAUFB106 4S 1S 32R 0.25S 0.5S 2S＜0.032S 32R 16S 256R 32S 0.125S DSM-10140 64R 16MR 32R 8MR＞128R 4S 8R 32R 64S＞1 024R 64S 1S IMAUFB271 128R 4S 64R 4S＞128R 2S＞16R 2S 128S 512R 32S 2S IMAUFB272 16MR 16MR 32R 4S＞128R 4S 16R 32R 128S＞1 024R 16S 1S IMAUFB125 128R 8MR 64R 4S＞128R 4S 8R 32R 64S 512R 64S 2S IMAUFB126 16MR 8MR 32R 4S＞128R 4S 16R 32R 64S＞1 024R 64S 1S IMAUFB127 1S 0.25S 4S 0.125S＜0.25S 1S 0.5R 4S 2S 128R 8S＜0.032S IMAUFB134 4S 4S 4S 0.25S 8R 1S 16R 32R 32S 512R 16S 1S IMAUFB135 32R 4S 32R 4S 1S 2S 0.5R 32R 128S＞1 024R 32S 0.5S IMAUFB137 32R 0.25S 16R 0.125S＜0.25S 0.5S＞16R 16R 8S 64R 4S 0.25S IMAUFB139 4S 32R 16R 2S 128R 4S 16R 32R 128S＞1 024R 64S 2S IMAUFB140 64R 4S 64R 4S＞128R 4S 16R 32R 128S＞1 024R 64S 2S IMAUFB141 4S＜0.125S 4S 0.125S＜0.25S 0.125S 16R 4S 4S 256R 2S 0.0625S IMAUFB113 8MR 1S 8S 0.5S 128R 1S 8R 32R 128S 512R 64S 2S IMAUFB108 4S 0.25S 4S 0.25S 128R 1S 4R 32R 64S 256R 2S 0.25S IMAUFB110[9]4S[9]0.5S[9]1S[9]0.25S[9]0.5S[6]1S[9]＜0.032S[9]32R[9]8S[9]128R[9]8S[9]0.5S ATCC15707唑奈；Lin：利素霉林；Cli：克素霉；Neo：新素霉；Str：链素霉那；Kan：卡素霉大；Gen：庆林西苄；Amp：氨；ND：无性抗等；MR：中感；S：敏药：R：耐。素霉；Chl：氯素霉；Ery：红啶苄氧ciprofloxacin；Tri：甲星沙丙；Cip：环平福；Rif：利素环；Tet：四汀普福/达注丁

对双歧杆菌菌株耐药谱的测定，将有助于开发用于产品双歧杆菌计数的选择性试剂，提高对抗生素对正常肠道菌群影响的认识[13]。Xiao 等[14]从酸奶、膳食补充剂和婴儿粪便中分离出的双歧杆菌的MIC 值（n=23）与本研究显示的耐药谱的情况类似。卡那霉素是氨基糖苷蛋白合成抑制剂，作用于30 s 核糖体RNA 可导致对mRNA 密码的误读。从婴儿粪便中分离的双歧杆菌通常对氨基糖苷类抗生素具有耐药性[15-16]。此外，Aloisio 等[17]为了治疗新生儿肠道疾病，筛选出的15 株双歧杆菌分离株对卡那霉素具有耐药性 （MIC 64～256 μg/mL）。氨苄青霉素是β-内酰胺类抗生素，其与青霉素结合蛋白（PBP）的羧基末端结构域结合而导致青霉素结合蛋白（PBPs）的不可逆失活[18]，进而导致细胞壁结构的损伤，影响细胞壁的渗透性和细胞的生长[19]。根据欧洲食品安全管理局（EFSA）的断点测定标准，这5 个被评估的双歧杆菌亚种都对氨苄西林敏感，这与文献[20]，[21]，[22]的研究结果一致。

图1 20 株双歧杆菌菌株的MIC 值分布Fig.1 The MIC values distribution of 20 Bifidobacterium isolates

20 株双歧杆菌都对氨基糖苷类抗生素-庆大霉素和链霉素敏感，而MIC 值都较高。Georgieva等[22]研究表明链霉素对19 株双歧杆菌MIC 值都较高，在8～64 μg/mL 范围。

Behra-Miellet 等[24]用琼脂稀释法检测双歧杆菌菌株的MIC 值，在0.25～4 mg/L 范围，所有菌株对利奈唑胺表现出耐药性[23]。另一项研究[14]称，从日本市场上食品、膳食补充剂和药品中分离出来的23 株双歧杆菌都对利奈唑胺敏感。Xiao 等[14]以及Behra-Miellet 等[23]的研究也表明不同的双歧杆菌菌株对利奈唑胺表现出不同的耐药性。

Masco 等[24]报道动物双歧杆菌乳酸亚种和青春双歧杆菌菌株对奎奴普丁/达福普汀和利福平敏感，对甲氧苄氨嘧啶、环丙沙星、克林霉素和四环素有不同程度的敏感性和耐药性，这与本文结果相符。

双歧杆菌通常对氯霉素敏感[25-26]。此外，氯霉素的最高MIC 值为64 μg/mL，与Kheadr 等[16]研究结果一致；然而，商业双歧杆菌菌株，例如长双歧杆菌ATCC 27536、ATCC 15708、ATCC 15700 和假长双歧杆菌ATCC 25526 的MIC 值略高于此前报道。上述结果表明：双歧杆菌菌株具有特异性的抗生素耐药性。从犬和灵长类动物粪便中分离出来的双歧杆菌，据报道[27]对四环素以外的抗生素敏感。事实上，双歧杆菌对四环素和新霉素具有不同程度的敏感性[20]。在另一项研究中，从人类、动物和益生菌中分离出来的100 个双歧杆菌都对奎奴普丁/达福普汀敏感[24]。相比金黄色葡萄球菌和粪肠球菌，双歧杆菌基本不会对奎奴普丁/达福普汀产生耐药性[28]。

2.2 抗性基因检测结果

20 株双歧杆菌抗性基因的检测结果见表4。大多数的分离株含有tet（W）。分离株IMAUFB271和IMAUFB272 不含tet（W），而含有tet（K）基因。分离株IMAUFB125、IMAUFB134 和IMAUFB140 3 株菌株都有ant（6）和tet（W）基因。在20 株分离株中未检测到与其它抗生素耐药性相关的基因。

表4 20 株双歧杆菌分离株的抗性基因检测结果Table 4 Genotypic detection of resistance genes for 20 Bifidobacterium isolates

2.3 耐药性基因转移结果

选取检测出具有抗性基因并同时MIC 表现为抗性的8 株双歧杆菌作为供体 （见表5），乳酸乳球菌MG1614 和粪肠球菌181 作为受体，进行筛选交配试验，评估耐药基因的转移潜力。

表5 试验用供体菌株Table 5 Donor isolates used in the experiment

在滤膜杂交后的选择性培养基中，没有产生转化结合子的菌落，说明没有发生耐药基因的转移。一些双歧杆菌的其它种属可能会携带这种基因，例如动物双歧杆菌乳酸亚种DSM-10140 因tet（W）的存在而具有四环素抗性[29]。Moubareck 等[30]的研究中，35 株嗜热双歧杆菌 （B.thermophilum）和3 株假长双歧杆菌菌株中因具有tet（W）基因而同样具有四环素抗性。许多细菌分离株，特别是革兰氏阳性细菌分离株都含有多种四环素抗性基因。然而，到目前为止，在双歧杆菌抗性基因的研究中，还没有出现过多重四环素抗性基因。

基因的水平转移可以通过转化、转导或结合发生，而结合在乳酸菌和双歧杆菌的耐药基因转移过程中十分重要。本文评估了双歧杆菌和乳酸乳球菌（L.lactis） MG1614 或粪肠球菌181 之间抗生素耐药基因水平转移的潜力。据报道，大约14%～30%的双歧杆菌对四环素具有耐药性[30]。在菌株动物双歧杆菌乳酸亚种Bb-12 中同样存在tet（W）基因，而耐药基因没有转移到任何受体菌株中[31]。初步试验数据表明，长双歧杆菌H66 和长双歧杆菌L42 也没有将tet（W）转移到易感菌株。据报道，erm（X）基因的决定因素由Tn5432 转座子携带，在长双歧杆菌SQS4-63 和长双歧杆菌SQS7-31 中同时存在[32]。这表明erm（X）基因可以从长双歧杆菌水平转移到其它双歧杆菌属。从双歧杆菌中很少检测到耐抗生素耐药性质粒和基因转移原件；事实上，在双歧杆菌中几乎没有发现关于耐药基因的可转移原件[33]。此外，双歧杆菌的转座结合机制也降低了耐药基因的转移效率[34-35]。

3 结论

本试验中检测来自中国的20 株双歧杆菌的抗生素耐药性，评估这种耐药基因转移到其它物种的能力。这些双歧杆菌分离株对15 种抗生素的敏感性和耐药性类似，它们对某些抗生素的敏感性因物种不同而不同，甚至同一物种的不同菌株对抗生素耐药性也不同。部分菌株经PCR 鉴定具有耐药基因，这些菌株将耐药基因保留在菌株内，不会转移到其它细菌甚至于致病菌中。这表明双歧杆菌与进一步出现的抗生素耐药性细菌无关，20 株双歧杆菌是安全的。