猴头菇菌丝体/子实体多糖对胃黏膜的保护作用

袁尔东 黄 敏 李 良 杨宜婷 任娇艳，3*

（1 华南理工大学食品科学与工程学院 广州510641 2 无限极（中国）有限公司 广州510665 3 中新国际联合研究院 广州510006）

猴头菇（Hericium erinaceus）又名猴头、猴头蘑、猴头菌、刺猬菌等，是一种大型真菌，属担子菌纲、多孔菌目、齿菌科、猴头属，因其子实体形状像猴子头部而得名。猴头菇含有丰富的蛋白质、脂肪、纤维素、多糖及多种氨基酸，子实体和菌丝体均可入药，性平味甘，具有助消化、利五脏的功能[1]。其中，猴头菇多糖是猴头菇的主要活性成分。它是由10 个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物，存在于菌丝、子实体和发酵液中，是目前研究最多的猴头菇活性成分之一。大量的医学和药理学研究表明，猴头菇多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂等生理功能[2]。其中，关于猴头菇多糖对胃黏膜保护作用的研究较少。本文以猴头菇菌丝体/子实体粗多糖为原料，对其进行初步提纯，从细胞水平上研究其胃黏膜的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猴头菇子实体粗多糖、猴头菇菌丝体粗多糖，由无限极（中国）有限公司提供；吲哚美辛，Sigma公司；人胃黏膜上皮细胞（GES-1），南方医科大学友情提供；DMEM 高糖培养基、胎牛血清（FBS）、双抗、胰酶Trypsin-EDTA、PBS，广州真知生物科技有限公司。

1.2 主要仪器、设备

UV754N 紫外分光光度计，上海仪电有限公司；H2050R 高速离心机，湘仪动力测试仪器有限公司；TDZ4-WS 低速自动平衡离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；SW-CJ-2FD 洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；HERAcell150i CO2细胞培养箱，Thermo Scientific；THZ-82A 恒温振荡器，常州溪华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 猴头菇菌丝体/子实体多糖的提纯 将猴头菇菌丝体粗多糖及子实体粗多糖原料初步提纯，选择提取温度为70，80，90 ℃，提取时间1，2，3 h，料液比1∶10，1∶15，1∶20 进行单因素提取[3]。提取2 次，合并提取液，浓缩后以80%乙醇沉淀过夜、过滤、冷冻干燥，最后得到猴头菇菌丝体多糖和子实体多糖。

1.3.2 多糖纯度的测定 参考张素斌等[4]的测定方法，稍作修改。准确吸取0.1 mg/mL 葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置于试管中，各加入蒸馏水使总体积为2.0 mL，再加入质量分数5%的苯酚溶液1 mL，摇匀。迅速加入5 mL 浓H2SO4，摇匀，沸水浴加热15 min 后取出冷却至室温。于波长490 nm 处测定吸光度A，得出A 与质量浓度c （mg/mL） 的葡萄糖标准曲线的回归方程：A=0.01446c+0.04129，R2=0.9981。

吸取一定体积的样品溶液，用同样方法检测，根据葡萄糖标准曲线计算样品的总糖含量。

1.3.3 胃黏膜保护作用细胞试验

1.3.3.1 细胞培养 将GES-1 细胞置于DMEM培养液（含10%胎牛血清，1%双抗）中，于CO2细胞培养箱中培养，培养条件：37 ℃、5%CO2。当培养皿中细胞生长近80%细胞基本贴壁时，用0.25%胰酶1～2 mL 在培养箱内消化2～3 min，在显微镜下观察到细胞变圆、散开时，加入4～5 mL DMEM培养液终止消化，1 000 r/min 离心5 min，重悬均匀后在小皿中继续培养[5]。

1.3.3.2 MTT 试验 取对数生长的GES-1 细胞消化计数后接种于96 孔细胞培养板中，每孔1×104个，37℃、5%CO2培养24 h 至细胞基本贴壁。将猴头菇多糖用DMEM 稀释成15.625，32.250，62.500，125.000，250.000 μg/mL，分别加入各孔中，每孔100 μL。每一稀释度设置5 个复孔，同时设立空白对照组。37 ℃、5%CO2温育24 h 后，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，继续培养使其反应4 h，小心用注射器吸取孔内培养液，丢弃。然后，每孔加入150 mL DMSO 溶液，放入酶标仪中，振板10 min，测定其波长490 nm 处吸光值。每个样品独立测量3 次，计算各组细胞的相对存活率。

1.3.3.3 GES-1 细胞损伤模型的构建 取对数生长的GES-1 细胞消化计数后接种于96 孔细胞培养板中，每孔1×104个，37 ℃、5% CO2培养24 h至细胞基本贴壁。将造模药物吲哚美辛用DMEM培养基稀释成0.4，0.8，1.2，1.6，2 mmol/L[6]，经0.22 μm 滤膜过滤除菌后分别加入各孔中，每孔100 μL。每一稀释度设置5 个复孔，同时设立空白对照组。37 ℃、5%CO2温育24 h 后做MTT 试验。

1.3.3.4 猴头菇多糖对吲哚美辛诱导的GES-1 细胞损伤的保护作用 取对数生长的GES-1 细胞消化计数后接种于96 孔细胞培养板中，每孔1×104个。将GES-1 细胞随机分为5 组：空白对照组、模型组以及3 个试验组，每组设置5 个复孔。待细胞完全贴壁后，将每孔细胞培养液吸走，空白对照组和模型组加入DMEM 培养基100 μL/孔，试验组则分别加入 15.625，32.250，62.500 μg/mL的猴头菇多糖样品100 μL/孔，继续孵育24 h。除空白对照组外，其余各组加入2.0 mmol/L 吲哚美辛溶液100 μL/孔，37 ℃、5%CO2温育24 h 后 做MTT 试验。

1.4 数据分析

测定结果以P<0.05 为显著性评定指标，数据用x±SD 表示。采用Graph prism 制图，并用SPSS 进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 吲哚美辛诱导GES-1 细胞损伤模型

非甾体抗炎药（NSAIDs）是最常用于治疗关节炎，炎症和心血管保护的药物，同时也经常引起胃肠道并发症[7]。其原因主要是由于NSAIDs 可抑制环氧合酶COX-1、COX-2 的作用，使得具有胃肠道黏膜保护作用的前列腺素的合成减少，从而引起胃肠道黏膜血供减少，进一步损伤黏膜上皮，导致糜烂和溃疡形成[8-9]。选用NSAIDs 吲哚美辛进行人胃黏膜上皮细胞 （GES-1） 损伤模型的构建。

由图1可知，不同浓度的吲哚美辛诱导的GES-1 细胞损伤的存活率具有显著性差异 （P<0.05）。随着吲哚美辛浓度的升高，细胞存活率逐渐降低，当吲哚美辛浓度为1.6 mmol/L 时，细胞存活率下降趋势缓慢；当吲哚美辛浓度为2.0 mmol/L 时细胞存活率约为60%[10]。最终选择2.0 mmol/L吲哚美辛诱导24 h，成功构建GES-1 细胞损伤模型。

2.2 猴头菇粗多糖对GES-1 细胞的保护作用

2.2.1 猴头菇粗多糖对GES-1 细胞的增殖作用

由图2可知，猴头菇菌丝体粗多糖和子实体粗多糖均能显著促进GES-1 细胞的增殖，并呈现明显的剂量-效应关系。

图2 猴头菇粗多糖对GES-1 细胞的影响Fig.2 Effect of crude polysaccharide from Hericium erinaceus on GES-1 cell

2.2.2 猴头菇粗多糖对受损GES-1 细胞的保护作用 由图3可知，猴头菇菌丝体粗多糖和子实体粗多糖可明显提高受损GES-1 细胞的存活率。与空白对照组相比，模型组的细胞存活率均明显下降，说明吲哚美辛对GES-1 细胞具有明显的损伤作用，GES-1 细胞损伤模型造模成功[11]。与模型组相比，试验组的细胞存活率明显上升，说明两种粗多糖对受损GES-1 细胞具有明显的保护作用。

图3 猴头菇菌丝体粗多糖（a）、子实体粗多糖（b）对受损GES-1 细胞存活率的影响Fig.3 Effect of crude polysaccharide from Hericium erinaceus mycelium （a） and fruiting body crude polysaccharide （b）on the cell viability of injured GES-1 cells

2.3 猴头菇粗多糖提纯工艺的优化

分别在不同料液比、提取温度及提取时间的条件下，对猴头菇菌丝体粗多糖和子实体粗多糖进行提纯，以多糖纯度及对吲哚美辛损伤GES-1细胞的保护作用为指标，对其提纯工艺条件进行优化。

2.3.1 料液比 如图4a、5a 所示，在提取料液比1∶15 的条件下，得到菌丝体多糖和子实体多糖的纯度均较高，其对受损细胞的保护作用也最明显。最终选择最佳提取料液比为1∶15。

由图4和图5可知，猴头菇菌丝体多糖和子实体多糖的多糖纯度不尽相同，这与其生长环境和培养方式等密切相关[12]。菌丝体多糖纯度均在50%～60%，而子实体多糖纯度在40%～50%，猴头菇菌丝体多糖的纯度稍高于子实体多糖。在提取料液比1∶15 条件下得到的菌丝体多糖和子实体多糖的多糖纯度均明显较高。

由图4b、4c 和图5b、5c 可知，猴头菇菌丝体多糖和子实体多糖均可明显提高受损GES-1 细胞的存活率（P<0.05），说明它们对吲哚美辛诱导的细胞损伤保护作用明显。当料液比为1∶15 时，猴头菇菌丝体多糖组和子实体多糖组的细胞存活率均高于其它两组，表明此料液比下多糖的细胞保护作用较好。

图4 不同料液比条件下猴头菇菌丝体多糖纯度及其对受损GES-1 细胞的保护作用Fig.4 Hericium erinaceus mycelium polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells at different solid-liquid ratios

图5 不同料液比条件下猴头菇子实体多糖的纯度及其对受损GES-1 细胞的保护作用Fig.5 Hericium erinaceus fruit body polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells at different solid-liquid ratios

2.3.2 提取温度 如图6、图7所示，温度对猴头菇菌丝体粗多糖和子实体粗多糖的提纯影响显著，在80 ℃条件下得到菌丝体和子实体多糖的纯度均较高，对吲哚美辛损伤细胞的保护作用也最明显。最终选择最佳提取温度为80 ℃。

由图6a 和图7a 可知，不同温度条件下提取得到的猴头菇菌丝体多糖和子实体多糖的多糖纯度也有所不同，80 ℃条件下得到的多糖纯度较高。

由图6b、6c 和图7b、7c 可知，不同提取温度条件下猴头菇菌丝体多糖和子实体多糖均可明显提高受损GES-1 细胞的存活率（P<0.05）。当提取温度为80 ℃时猴头菇菌丝体多糖组和子实体多糖组的细胞存活率均略高于其它两组，表明此温度下多糖对受损GES-1 细胞保护作用较好。

图6 不同提取温度下猴头菇菌丝体多糖纯度及其对受损GES-1 细胞的保护作用Fig.6 Hericium erinaceus mycelium polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells at different extraction temperatures

图7 不同提取温度条件下猴头菇子实体多糖的纯度及其对受损GES-1 细胞的保护作用Fig.7 Hericium erinaceus fruit body polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells under different extraction temperatures

2.3.3 提取时间 如图8、图9所示，提取时间不同，得到猴头菇菌丝体和子实体多糖的纯度和受损GES-1 细胞的保护作用也不相同，其中以提取2 h 条件下的效果为最佳。最终选择最佳提取时间为2 h。

图8 不同提取时间下猴头菇菌丝体多糖的纯度及其对受损GES-1 细胞的保护作用Fig.8 Hericium erinaceus mycelium polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells at different extraction times

图9 不同提取时间的猴头菇子实体多糖纯度及其对受损GES-1 细胞的保护作用Fig.9 Hericium erinaceus fruit body polysaccharides’ purity and its protective effect on injured GES-1 cells at different extraction times

由图8a 和图9a 可知，不同提取时间条件下猴头菇菌丝体和子实体多糖纯度有所不同，提取时间2 h 条件下多糖纯度较高。

由图8b、8c 和图9b、9c 可知，不同提取时间条件下猴头菇菌丝体多糖和子实体多糖可明显提高受损GES-1 细胞的存活率（P<0.05）。其中，以提取2 h 后得到的猴头菇菌丝体多糖和子实体多糖对受损CES-1 细胞的保护效果为最好。

2.4 最优工艺条件下猴头菇多糖纯度及其对受损GES-1 细胞的保护作用

研究表明，不同部位的原料以及提取条件、菌种以及生长条件等，都影响多糖含量[13-14]。

根据上述工艺优化试验，得到猴头菇菌丝体粗多糖和子实体粗多糖的最优提纯工艺条件：料液比1∶15、提取温度80 ℃、提取时间2 h。在此条件下，由猴头菇粗多糖提取到的猴头菇多糖纯度明显提高（图10）。其中，菌丝体多糖纯度由40%增到50%，子实体多糖纯度由35%增到42%。同时，提纯的猴头菇多糖对受损GES-1 细胞的保护作用也明显增强（图11），其细胞存活率明显提高。

图10 猴头菇菌丝体粗多糖和子实体粗多糖提纯前、后多糖纯度的对比Fig.10 Comparison of polysaccharides’ purity before and after purification of Hericium erinaceus

图11 猴头菇菌丝体多糖（a）、子实体多糖（b）对受损GES-1 细胞存活率的影响Fig.11 Effect of Hericium erinaceus mycelium polysaccharide （a） and fruiting body polysaccharide（b）on cell viability of injured GES-1 cells

3 结论

1）猴头菇菌丝体粗多糖和子实体粗多糖均能显著促进GES-1 细胞的增殖，并呈现明显的剂量-效应关系。两种粗多糖对吲哚美辛诱导的GES-1 细胞损伤有明显的保护作用，可提高其细胞存活率。

2）以多糖纯度及对受损GES-1 细胞的保护作用为指标，对猴头菇菌丝体粗多糖和子实体粗多糖提纯工艺条件进行优化，得到最优提纯工艺条件：料液比1∶15、提取温度80 ℃、提取时间2 h。在此条件下，菌丝体多糖纯度由40%增到50%，子实体多糖纯度由35%增到42%。同时，提纯后的猴头菇菌丝体多糖和子实体多糖对受损GES-1 细胞的保护作用也明显较强，其细胞存活率明显提高。