氨基甲酸乙酯在酱油发酵过程中的形成机理研究

白晓娟，高荣锟

(1.晋中职业技术学院，山西 晋中 030600；2.山西农业大学，山西 晋中 030801)

氨基甲酸乙酯是酒精饮料和发酵酱油中的一种常见物质，其形成过程复杂。可通过对酱油中氨基甲酸乙酯前体物质的含量控制来间接控制其生成过程，利用生化方法可直接检测酱油中氨基甲酸乙酯前体物质含量变化[1,2]。

本文研究氨基甲酸乙酯在酱油发酵过程中的形成机理，通过对酱油发酵不同阶段的氨基甲酸乙酯含量和其前体物质尿素、精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸的含量进行检测，建立氨基甲酸乙酯与其前体物质之间的变化关系，来获取酱油中氨基甲酸乙酯的形成机理。

1 氨基甲酸乙酯介绍

氨基甲酸乙酯是一种酯类物质，并含有大量的氨基酸，是一种无色晶体，无臭味，易溶解于水和乙醇中[3]。氨基甲酸乙酯在医药合成过程中具有广泛的用途，同时也是一种麻醉剂。氨基甲酸乙酯可通过粉尘或者饮食过程进入人体，是淋巴癌或肺癌的主要致癌点[4]。氨基甲酸乙酯可作为农药的中间体，用于化工领域，同时可用于麻醉剂的生产过程中。

在酱油发酵过程中随着氨基甲酸乙酯前体物质的不断变化，而产生不同特性的氨基甲酸乙酯[5]。氨基甲酸乙酯的前体物质主要包含尿素、精氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸，前体物质在酱油酿造过程中的变化规律具有一定的相关性[6]。

2 氨基甲酸乙酯前体物质检测

在酱油发酵过程中，从第10天开始，每隔10 d提取酱油发酵样品，直至整个酱油发酵周期完成。对提取的酱油发酵样品采用8层纱布进行过滤，获得液态酱汁，分别取10 g后进行固相萃取及标准检测处理[7,8]。在两种检测试验条件下分别检测其中的氨基甲酸乙酯、尿素、精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸含量，其中一组添加酵母，一组不添加酵母，每种成分的检测进行3组试验检测，取其平均值。

本文所用的发酵酱油原材料为豆粕和麸皮，所选酵母为鲁氏酵母，酵母培养基中添加0.3 g酵母浸粉，0.6 g葡萄糖，0.6 g蛋白胨以及少量的水，并在115 ℃条件下进行灭菌。

在酱汁中，尿素可被酵母吸收，形成尿素的循环代谢。当酱汁中的精氨酸含量抑制了酵母细胞的代谢时，尿素无法进行有效的代谢循环，此时酵母细胞中的尿素排入酱汁[9]。尿素无臭无味，可溶于酒精和水中，是酱油发酵过程中微生物的主要氮物质来源。对于尿素的检测主要通过测量有色物质溶液的颜色来进行组分检测，将光度计的检测结果换算成尿素含量。尿素的检测波长为422 nm，测量范围可达到8.8～107 mg/L。酱汁中尿素含量变化曲线见图1。

图1 尿素含量变化曲线

由图1可知，在酱油发酵过程中，酱汁中的尿素整体含量先下降后上升。在发酵初期，尿素含量不断降低，第30天时，在不添加酵母的酱汁中尿素含量为18 mg/L，在添加酵母的酱汁中尿素含量为8 mg/L。从第30天开始，酵母自身开始产生尿素，因此酱汁中的尿素含量不断上升，不添加酵母的酱汁中尿素含量明显高于添加酵母的酱汁中尿素含量。

随着酱油发酵时间的推移，酱汁中的微生物将大分子蛋白质进行分解，产生精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸，该类氨基酸是氨基甲酸乙酯的前体物质[10]。酱汁中精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸含量的变化规律决定了酱汁中氨基甲酸乙酯的含量。

精氨酸可在碱性溶液中发生反应，生成次氯酸盐等橙红色物质，进一步通过比色法来进行精氨酸含量检测。酱汁中精氨酸含量变化曲线见图2。

图2 精氨酸含量变化曲线

由图2可知，在酱油发酵过程中，酱汁中的精氨酸整体含量先上升后下降，随着发酵时间的不断推移，酱汁中的精氨酸含量变化逐渐平缓。不添加酵母的酱汁中精氨酸在第30天达到最大值3300 mg/L，添加酵母的酱汁中精氨酸在第70天达到最大值2700 mg/L。在发酵初期，酱汁中微生物不断分解蛋白质，使精氨酸含量上升，随着酱油原料物质中蛋白质的逐渐减少和微生物对精氨酸进行分解，精氨酸含量逐渐降低，并最终趋于平缓。发酵初期，因酵母对精氨酸的代谢作用，添加酵母的酱汁中精氨酸含量低于未添加酵母的酱汁中精氨酸含量。发酵后期，添加酵母的酱汁中精氨酸减少速度低于未添加酵母的酱汁中精氨酸减少速度。

瓜氨酸可在酸性条件下生成丁二酮，并在强酸环境中发生缩合，形成红色的化合物。瓜氨酸含量变化曲线见图3。

图3 瓜氨酸含量变化曲线

由图3可知，在未添加酵母的酱汁中，瓜氨酸含量先上升后下降再上升，并在发酵后期达到近似平缓状态，在发酵第30天时，瓜氨酸达到最大值3750 mg/L。在添加酵母的酱汁中，瓜氨酸含量逐渐上升，在发酵第60天时达到平缓状态。由此说明酵母抑制了瓜氨酸的增长，使瓜氨酸变化规律为逐渐上升并最终处于平缓状态。

鸟氨酸可在茚三酮混合性酸性溶液的显色作用下，发生水浴反应，并在510 nm波长照射下，进行鸟氨酸测定。鸟氨酸含量变化曲线见图4。

图4 鸟氨酸含量变化曲线

由图4可知，酱汁中鸟氨酸含量逐渐上升后下降，并最终基本处于平缓状态，鸟氨酸含量在第50天时达到最大值，且添加酵母的酱汁中鸟氨酸含量高于未添加酵母的酱汁中鸟氨酸含量，其主要原因是在酱油发酵过程中，酵母可以分解酱汁中的蛋白物质，产生鸟氨酸。

3 氨基甲酸乙酯与尿素及氨基酸关系

在酱油生产过程中，对氨基甲酸乙酯的控制是通过对其前体物质的控制来研究的，各物质之间存在相互转化过程，并共同影响酱汁中氨基甲酸乙酯的形成。为此在未添加酵母的条件下，建立酱汁中氨基甲酸乙酯与其前体物质之间的变化关系。氨基甲酸乙酯不易挥发，溶解度较小，在较高的压力下形成蒸汽。氨基甲酸乙酯可在展开溶剂的条件下，利用362 nm波长的紫外光进行照射，形成蓝紫色的荧光斑点，对酱汁中的氨基甲酸乙酯进行半定量分析。

为研究酱油中氨基甲酸乙酯与尿素之间的关系，本文将酱汁中的尿素与氨基甲酸乙酯含量变化过程进行对比。氨基甲酸乙酯与尿素之间的关系曲线见图5。

由图5可知，随着酱油发酵过程的进行，酱汁中氨基甲酸乙酯含量与尿素含量都出现上升状态，且变化趋势基本相同。在酱油发酵的开始阶段，尿素作为发酵过程中的氮源，随着微生物的代谢，尿素外排，酱汁中的尿素含量发生变化。酱汁中的氨基甲酸乙酯与尿素之间存在一定的关系，且尿素含量越高，氨基甲酸乙酯的含量越高。

为研究酱油中氨基甲酸乙酯与氨基酸之间的关系，本文分别将酱汁中的精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸与氨基甲酸乙酯含量变化过程进行对比。氨基甲酸乙酯与精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸之间的关系曲线见图6。

图6 氨基甲酸乙酯与氨基酸的关系

由图6可知，随着酱油发酵过程的进行，氨基甲酸乙酯含量逐步上升；精氨酸含量先上升后下降；鸟氨酸含量逐步上升，并最终处于平稳状态；瓜氨酸含量逐步上升，并最终处于平稳状态。在酱油的发酵过程中，精氨酸逐步被生物分解利用，含量逐步降低，根据酱汁中氨基酸的组合排布形式，初步预测精氨酸代谢途径，随着精氨酸的分解，瓜氨酸和鸟氨酸含量逐步上升，表明瓜氨酸存在其他的代谢过程。因为几种氨基酸之间存在相互转化，因此氨基酸之间的相对含量共同影响氨基甲酸乙酯的形成过程。

4 结论

尿素、精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸作为酱油氨基甲酸乙酯的前体物质，其变化规律可间接反映氨基甲酸乙酯的形成规律。在酱油发酵初期，尿素含量快速降低，随着发酵过程的进行，尿素含量逐步上升，其中氨基甲酸乙酯的含量也逐步上升，表明酱汁中尿素促进了氨基甲酸乙酯的形成。在发酵初期，精氨酸、瓜氨酸和鸟氨酸含量逐步升高，发酵中前期下降，并开始逐步上升，最终处于平稳状态，氨基甲酸乙酯含量逐步上升，在发酵后期基本处于平稳状态。表明几种氨基酸前体物质含量与氨基甲酸乙酯含量之间的变化趋势基本相同，随着发酵过程中微生物的作用，相互关系之间存在一定的波动性。