滨海白首乌离体茎段丛生芽的诱导培养研究

●顾 乔（江苏省盐城市滨海中学 江苏 盐城 224000）

白首乌（Cynanchum bungeiDecne）是萝藦科鹅绒藤属多年生缠绕性草本植物，盐城滨海特有的中药材，膨大块根为主要药用部位[1]。现代医学研究表明，白首乌具有提高机体免疫力、抗衰老、促进毛发生长、抗肿瘤、保护脑细胞、改善大脑记忆力和调节中枢神经、保肝、强心、降脂以及对单胺氧化酶活性的抑制等作用[2-6]。白首乌的人工栽培主要靠块根的营养繁殖和种子育苗，易受病毒侵害，产量和品质受影响，阻碍了规模化和标准化生产。将组织培养技术运用到白乌首育种中，可促进其研究发展。

但目前关于白首乌组织培养方面的报道较少[7-9]。本研究以滨海白首乌带腋芽的茎段为试材，探究了最佳灭菌处理和植物生长调节剂浓度与种类组合，并诱导获得愈伤组织和丛生芽，为滨海白首乌的产业化生产提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为江苏省盐城市滨海县白首乌生产基地栽种的白首乌。在晴好天气的清晨，取田间的白首乌茎段作为外植体，茎段类型为带腋芽茎段。

1.2 方法

1.2.1 外植体的预处理剪去外植体的叶片，用软毛刷清洗茎段表面污垢，置于洗衣粉液中浸泡30min 后再用自来水冲洗2h，备用。

1.2.2 外植体的消毒与接种将外植体移入到超净工作台中，以灭菌后的刀片和镊子去除带腋芽的茎段芽鞘，剪成长5cm 左右的单芽茎段，置于无菌广口瓶中，以无菌水浸泡和清洗。可采用三种灭菌方法，分别为：75%酒精浸泡30s，无菌水清洗5 次，0.1%升汞浸泡10min，无菌水清洗5 次；75%酒精浸泡30s，无菌水清洗5 次，1.0%次氯酸钠浸泡10min，无菌水清洗5 次；5%酒精消毒30s，无菌水清洗5 次，0.1%吐温消毒10min，无菌水清洗5 次。灭菌后用无菌滤纸吸干水分，顶端向上并保持节位腋芽点处于MS 固体培养基（蔗糖30.0 g/L，琼脂6.0 g/L，pH=6.0）表面。

1.2.3 愈伤组织诱导培养基的筛选基本培养基为MS 固体培养基（蔗糖30.0 g/L，琼脂6.6 g/L，pH=6.0），分别添加不同浓度组合的6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）和IBA（吲哚丁酸），其中6-BA浓度分别为0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L，IBA浓度分别为0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L。以上每个处理接种3 瓶，每瓶接种8 个外植体。将外植体置于光照培养箱中，温度25±1℃，光照强度2 500lx，光照时间12h/d。定期观察：外植体接种30 d 后愈伤组织的质地、颜色和生长势，并计算愈伤组织的出愈率。计算方式为：

出愈率=（形成愈伤组织的外植体块数/接种外植体总块数）×100%。

1.2.4 丛生芽诱导培养基的筛选将愈伤组织接入含不同激素浓度组合的丛生芽诱导培养基中，其中NAA（萘乙酸）浓度分别为0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.04 mg/L，TDZ（噻苯隆）浓度分别为0.1 mg/L、0.15 mg/L、0.3 mg/L。以上每个处理接种3 瓶，每瓶接种8 块愈伤组织，称取愈伤组织的鲜重。外植体置于光照培养箱中，温度25±1℃，光照强度2 500lx，光照时间16h/d。定期观察：愈伤组织接种30d 后的形态变化并称量鲜重，计算增殖率与分化率。计算方式为：

增殖率（%）=（刚接入的愈伤组织鲜重/增殖后的鲜重）×l00%；

分化率（%）=（出芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织总数）×l00%。

1.3 统计分析方法

实验结果采用软件Excel 进行统计分析及制图。

2 结果与分析

2.1 消毒灭菌方法的筛选

白首乌外植体用不同的灭菌方法处理结果，见表1。可知，75%酒精+0.1%升汞灭菌效果最好，污染率为0，成活率90%；75%酒精+1.0%次氯酸钠灭菌效果最差，污染率100%；75%酒精+0.1%吐温灭菌效果较好，污染率为10%，但死亡个数多，可能是因为吐温的毒性对外植体造成了较大的伤害。

表1 不同灭菌处理对白首乌外植体诱导培养的影响（培养30d）

2.2 愈伤组织诱导培养基激素组合的筛选

带腋芽白首乌茎段在含不同浓度6-BA 和IBA 组合的MS 固体培养基上进行诱导培养，4d后发现部分处理的茎段与培养基相接处开始产生黄绿色愈伤组织，30d 后发现部分外植体的愈伤组织呈现逐渐膨大的现象，但未发现丛生芽组织的出现（图1）。

图1 带腋芽白首乌茎段的愈伤组织

由表2 可知，白首乌茎段在6-BA（2.0 mg/L）+IBA（0.2 mg/L）激素组合中出愈率最高，生长量最大，且愈伤组织未出现褐化现象。

表2 不同6-BA、IBA 浓度组合对愈伤组织的诱导

2.3 丛生芽诱导培养基激素组合的筛选

将生长周期为30d 的愈伤组织转入丛生芽诱导培养基MS+NAA+TDZ，连续培养30d 后发现愈伤组织生长均匀，生长量有所增加，且有部分愈伤组织中分化出绿色嫩芽（图2），即丛生芽的形成。

图2 丛生芽的诱导

由表3 可知，NAA（0.04 mg/L）+TDZ（0.3 mg/L）为最适组合，该浓度组合的增殖率与分化率最佳。

表3 不同NAA、TDZ 浓度组合对丛生芽的诱导

3 讨论

鉴于目前传统育种方法已很难满足供需之间差额的现状，利用组织培养手段快速繁殖药用植物对于满足市场需求和保护野生种植资源具有重大意义，已有较多研究者开展了针对药用植物的组织培养研究[10-15]。

本研究以滨海白首乌带腋芽茎段为组织培养的试材，即白首乌的茎节处产生腋芽，通过切割、转接从而达到增殖的目的[8]。多个研究亦证明该结果，以白首乌带腋芽茎段为试材可有效提高组织培养的整株获得率[7,8,16,17]。

本研究发现6-BA（2.0 mg/L）+IBA（0.2 mg/L）激素组合对于滨海白首乌愈伤组织的诱导效果最佳，与前人研究结论略有出入。徐飞等[17]发现1.5 mg/L 6-BA 有利于泰山白首乌愈伤组织的诱导，而KT 和NAA 组合的诱导率最高；余桂红等[7]发现1.0 mg/L 2,4-D 有利于泰安白首乌愈伤组织的诱导。推测这一差异可能是由于白首乌的来源地不同导致。

本研究发现NAA（0.04 mg/L）+TDZ（0.3 mg/L）激素组合对于滨海白首乌丛生芽的诱导效果最佳，NAA 作为一种植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大的作用，多被用于植物组织培养中不定芽和不定根的诱导剂，前人研究结果亦可证明，通过施加NAA 有利于白首乌丛生芽的诱导效应。徐飞等[17]证明0.05 mg/L 的NAA 最有利于白首乌腋芽增殖；余桂红等[7]发现MS+ZT（2.0 mg/L）+NAA（0.01 mg/L）对茎段的增殖作用最好。