ELI SA检测技术在猪流感病毒检测中的应用

郝卫芳

（山西省太原市动物预防控制中心太原 030000）

猪流感是由流感病毒所引起的，在生猪养殖过程中一种常见的急性、传染性呼吸道疾病，对于生猪养殖的健康水平以及生产性能均有非常大的负面影响。自从本世纪初的甲型H1N1 流感在畜牧养殖中大肆蔓延之后，对于流感病毒的检测方法开始逐渐受到人们的重视。现阶段主要的流感病毒检测方法有血清学诊断方法、分子生物学检测方法、量子点生物探针流式免疫技术以及液相芯片技术等，其中血清学检测方法中的酶联免疫吸附试验法（ELISA）是当前流感病毒检测中最常用的方法之一，ELISA 检测技术具有灵敏度高、特异性强以及试验操作相对简单的优势，给生猪疾病诊断带来了很大的便利。

1 ELI SA检测技术的基本原理

ELISA 检测技术早在上世纪70 年代开始应用，主要是通过抗原定位酶标抗体的方式进行应用，成为一种测定液体中微量物质的新技术。ELISA 检测技术的原理主要是通过具有免疫活性的抗原或者抗体通过包被在固态的某种载体上，通过将包被的载体与相应的样品相结合形成一种具有免疫活性或酶活性的酶标抗原或者抗体物质，再将其与这些具有酶活性的酶标抗原或者抗体物质进行反应后形成结合的复合物，通过下一步的洗涤去除杂质后，通过添加底物以及酶形成呈色反应，通过酶标仪定量或者定性分析，从而进行样品中物质的检测[1]。

2 ELI SA检测技术的分类

ELISA 检测技术按照不同的检测目的以及方法进行不同的分类，ELISA 检测技术可以用于检测抗原或者抗体，以及固相的抗原或者抗体免疫吸附剂、酶标记的抗原或者抗体结合物等。不同的ELISA 检测技术中酶反应底物是所必须的试剂，通过根据ELISA 检测技术中试剂之间的结合方式进行了不同的分类，主要的ELISA检测技术分类有ELISA 直接检测法、ELISA 间接检测法、ELISA 双抗夹心检测法、ELISA 捕获检测法、ELISA 竞争检测法等[2]。

3 ELI SA检测技术在猪流感病毒检测中的应用

ELISA 在猪流感病毒检测中的应用主要是通过依靠猪流感病毒纯化蛋白作为检测抗原或者抗体，血凝素（HA）作为猪流感病毒主要的表面抗原，是由HA1 蛋白和HA2 蛋白所组成，其中HA1 是高度进化的抗原或者抗体的结合区域，而HA2 相对而言较为保守，核蛋白NP 同HA2 蛋白相同也较为保守。在猪流感病毒检测的ELISA 检测技术中通常有ELISA 间接检测法、双抗体夹心ELISA 检测法、捕获法抗原ELISA 检测等。

3.1 ELI SA间接检测法

ELISA 间接检测法主要是通过利用酶标记的抗体来检测与固相载体上抗原所结合的待测抗体的检测方式，ELISA 间接检测的方法不但可以有效检测出猪流感病毒机体抗体水平，还可以准确的区分猪流感疫苗免疫抗体和各种猪流感亚型野毒感染所产生的机体抗体。现阶段通过利用H1 亚型猪流感病毒的HA1 纯化蛋白作为识别抗原，建立了科学有效的猪流感病毒ELISA 间接检测技术，通过检测血清中的猪流感病毒抗体的阳性符合率可以达到85%～95%左右，通过利用H3 亚型的流感病毒中的HA 和HA1 蛋白，将其纯化后使用单克隆抗体作为包被的抗原建立了ELISA 间接检测的方法，对于血清中猪流感病毒的检出率达到86%～93%左右[3]。有研究学者通过使用H5 亚型的猪流感病毒，以HA1 重组蛋白为基础建立ELISA 间接检测的方法，在患病动物血清中猪流感病毒准确检出率达到94%左右。通过利用H1、H3 以及H9 的亚型猪流感病毒建立基于M2 蛋白多肽抗原的间接ELISA 检测方法，发现可以有效检测出血清中多种流感病毒亚型的抗体，准确率可以达到98%以上。间接ELISA 检测方法的优点在于与包被抗原反应的抗体是不加酶的抗体，该抗体有效保留较高的免疫活性，通过酶标记的另一个二抗抗体可以有效的加强信号传导，间接ELISA 检测方法的缺点在于出现交叉反应的可能性比较高[4]。

3.2 双抗夹心ELI SA检测方法

双抗夹心ELISA 检测方法是通过将已知的抗体吸附到固相载体上后，将待测的抗原与吸附于固相载体的抗体结合后再与酶标记的二抗相结合的方法，这种检测方式适用于具有至少双表位的抗原。研究学者通过使用H1 亚型的猪流感病毒中HA 单克隆抗体，初步建立的猪流感病毒的双抗夹心ELISA 检测方法，检测血清样本中阳性样本的符合率达到96%左右。通过利用H9 亚型流感病毒的高免血清中的Ig G 作为包被抗体，再使用抗AIV-NP-7B4 单克隆抗体作为双抗夹心ELISA 检测方法的二抗，成功建立了猪流感病毒抗原的双抗夹心ELISA 检测方法，可以准确迅速的检出患病动物血清中H9 亚型猪流感致病性病毒。双抗夹心ELISA 检测方法的优点在于高度的灵敏性和专一性，同时抗原检测过程不需要纯化，双抗夹心ELISA 检测方法的缺点是此方法不适用于小分子半抗原的病毒检测，同时待检测的抗原需要拥有至少两个以上的抗体结合部位[5]。

4 结束语

ELISA 检测技术具有高度的灵敏性以及较强的特异性，同时具有操作方法简便、经济成本相对较低、检测造成的污染较小以及所需仪器设备常见、便宜等优势，该项检测技术缺点有抗原制备纯度，抗体制备的含量和纯度要求较高、较复杂和困难。另外ELISA技术应用于单克隆抗体的筛选、活性的测定以及制备纯化是大海捞针的工作量，也是制约ELISA 检测技术发展的一个重要瓶颈。未来将通过其他高端技术，精密仪器在ELISA 技术中的发展和应用，将不断提升ELISA 技术在动物疫病和人类疾病监测和诊断中的应用，将会是未来检测中不可取代的一项重要技术和手段。