米根霉预处理对巨菌草与牛粪混合厌氧发酵特性的影响

骆小玉 涂海蓉 邹书珍

摘 要 研究利用米根霉将巨菌草预处理后与牛粪混合发酵，测定发酵初始环境中环境因子与发酵酸化阶段的环境因子和微生物群落结构，并分析发酵初始环境、发酵酸化阶段环境因子和微生物群落特征之间的关系。研究结果表明，米根霉预处理能够显著提高巨菌草和牛粪混合发酵的沼气产量（P<0.05），并且使日产气量的峰值及峰值出现的时间提前，巨菌草被预处理6 d的总产气量最高，为17 775 mL，是未经预处理的1.80倍。预处理使发酵初始环境中的还原性糖含量和VFA（挥发性脂肪酸）含量提高，可缓解酸化阶段因pH降低产生的危害。

关键词 巨菌草;牛粪;厌氧发酵;米根霉

中图分类号：S216.4;X71 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.26.074

当前，全球正处在经济大发展的时代，能源被大量消耗，同时也带来了巨大的环境污染问题。能源供应和环境问题成为制约中国社会经济可持续发展的两大挑战[1]。巨菌草作为能源作物推广利用，具有广阔的前景，在我国的循环农业中占据重要地位[2]。

但巨菌草木质素含量高，直接发酵可能存在效率低、启动慢等问题[3]。利用能够产生纤维素酶的微生物对纤维素类物质进行预处理近年来被广泛应用到厌氧发酵原料的预处理中。微生物中的丝状真菌产生的纤维素酶对纤维素的水解效率高[4]。近年来，有学者利用米根霉发酵产生纤维素酶，纤维素底物糖化后又产生有机酸。米根霉预处理后对厌氧发酵水解和酸化阶段可能产生影响，但将米根霉用到厌氧发酵底物巨菌草的预处理当中，对厌氧发酵特性产生怎样影响，尤其是酸化阶段的特性却很少有人研究。

基于此，利用米根霉对生长后期巨菌草进行预处理，之后与牛粪进行混合厌氧发酵，测定发酵过程中纤维素酶活力、还原性糖含量、VFA含量、铵态氮含量和pH，并且测定发酵酸化阶段的细菌和古菌的多样性，探讨预处理对发酵系统微生物和理化性质的影响。本研究可为拓宽厌氧发酵原料预处理方式以及后续真菌预处理发酵原料的研究提供理论基础，研究结果可以指导实践生产。

1 材料与方法

1.1 米根酶扩大培养及巨菌草预处理方法

首先利用PDA培养基对米根酶进行活化处理，制作米根酶扩大培养的液体培养基。将自然晾干的巨菌草（干物质含量为89.2%）粉碎成1～2 cm的小段，之后称取31.39 g（干物质为28g）的晒干巨菌草4份备用，每份巨菌草加入150 mL的米根酶发酵液，随后将其分别预处理2 d、4 d、6 d和8 d，及处理D2、D4、D6、D8，每天定时搅拌，每个实验设施3个重复。对照（CK）为未经预处理的巨菌草秸秆。

1.2 发酵原料和接种物

巨菌草取自四川省南充市生态养殖场，该草生长3年，植株高大。牛粪取自四川省南充市生态养殖场。接种物取自西华师范大学实验室以牛粪为底物驯化30 d的沼气发酵罐。发酵方法和发酵装置参考邹书珍和康迪等[3]的研究结果。

1.3 指标测定方法

1.3.1 微生物测定方法

高通量（Illumina Miseq）测序由上海派森诺生物科技有限公司（中国上海）进行。使用细菌通用引物338F和806R扩增V3-V4区，使用Illumina Miseq对扩增子文库进行测序，用www.i-sanger.com对微生物门至属进行菌群结构分析。

1.3.2 测定项目及方法

采用烘干法测定总固体质量、挥发性固体质量、总氮含量、总有机碳含量，VFA含量的测定方法参考Zou and Kang的相关研究[5];发酵过程中纤维素酶活力和还原性糖含量均利用DNS 比色法测定[6]。用智能pH计（pHs-3CT型）测定发酵产物中的pH;利用排水法测定每日产气量。

1.4 数据分析与整理

利用Office 2010对数据进行初步整理，利用IBM SPSS 21软件对数据进行方差分析，利用Oringin软件制作柱形图。

2 结果与分析

2.1 预处理对厌氧发酵产气量的影响

如图1所示，CK（未经预处理）第一次产气高峰出現在发酵的第14天，而被米根霉预处理2 d、4 d、6 d和8 d的处理组的第一次产气峰值分别出现在厌氧发酵的第6天、第4天、第8天和第9天。对照日产气量最大值为845 mL，被米根霉预处理8 d日产气量最高为

1 200 mL。对照的总产气量为9 895 mL，米根酶预处理巨菌草后与牛粪混合厌氧发酵后产气量显著提高。其中巨菌草被米根霉预处理4 d后与牛粪混合厌氧发酵的总产气量最高，为17 775 mL，是CK的1.8倍。经米根霉预处理的处理组日产气量的第一次产气高峰提前，发酵过程中日产气量最大值增加，总产气量显著提高。该研究结果进一步证明了预处理能够提高厌氧发酵的产气量，与前人研究结果一致[7]。

2.2 米根霉预处理对厌氧发酵初始环境因子的影响

厌氧发酵的发酵初始环境受预处理条件的影响[8]。因此，研究发酵初始环境因子的变化特征对评估厌氧发酵过程中环境因子的变化有重要意义。预处理后发酵初始环境中的纤维素酶活力和还原性糖含量升高。这是因为巨菌草中含有能够被米根霉利用的物质，米根霉的代谢活动能够产生一定的纤维素酶，之后会分解巨菌草中的纤维素而产生还原性糖，且米根霉能生产淀粉酶和糖化酶将巨菌草中的淀粉等物质分解成还原性糖[9]。米根霉将底物发酵后会产生游离脂肪酸和氨类物质，相应的发酵初始环境中的VFA含量和铵态氮含量提高，但酸性物质也会消耗一定的游离铵态氮，能决定预处理后发酵初始环境的pH值，因此经米根霉预处理后发酵初始环境中氨态氮含量和pH表现出或升高或降低的现象（图2）。

2.3 预处理对厌氧发酵酸化阶段环境因子的影响