LC-MS/MS法同时快速检测牛肉中12种β-受体激动剂的应用研究

张洋

β-受体激动剂，俗称瘦肉精，不是某一种特定的药物，而是一类药物，能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长。当它们以超过治疗剂量5-10倍的用量用于家畜饲养时，即有显著的营养“再分配效应”，促进动物体蛋白质沉积、促进脂肪分解抑制脂肪沉积，能显著提高胴体的瘦肉率、增重和提高饲料转化率，因此曾被用作牛、羊、禽、猪等畜禽的促生长剂、饲料添加剂。[1-3]

但瘦肉精用量大、作用的时间长、代谢慢，所以在屠宰前到上市，在动物体内的残留量都很大。这个残留量通过食物进入人体，就使人体渐渐地中毒，如果一次摄入量过大，就会出现异常的生理反应，因此而被禁用。人若食用含瘦肉精的肉类后会出现头晕、恶心、手脚颤抖、心跳加速甚至心脏骤停致昏迷死亡，特别对心律失常、高血压、青光眼、糖尿病和甲状腺机能亢进等患者有极大危害。[4-7]

在中国，通常所说的“瘦肉精”则是指盐酸克伦特罗。它曾经作为药物用于治疗支气管哮喘，后由于其副作用太大而遭禁用。其它类似药物还有沙丁胺醇和特布他林等，都因为对人体健康危害过大，造成安全隐患，而在全球遭到禁用。在2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，农业部分别下发文件禁止食品动物使用β-受体激动剂类药物作为饲料添加剂（农业部176号、193号公告、1519号条例）[8-12]。

因为能够促进瘦肉生长、抑制动物脂肪生长，瘦肉精让猪、牛、羊等牲畜的瘦肉率提高，带来更多经济价值，国内养殖户不顾农业部的规定，在饲料中掺入过量瘦肉精，给市场上的肉类食品带来了严重的安全隐患，所以研究出科学、高效、快速、准确的检测方法十分必要。

目前常用的β-受体激动剂检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱联用法（GC/MS）、酶联免疫法（ELISA）和液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）。其中HPLC法灵敏度较低，不能满足痕量检测要求[13-15];GC/MS法除了需要大量的前处理步骤，还要求进行衍生化操作，较为繁琐;ELISA法虽然操作简单，但极容易出现假阳性情况，定性结果的准确性较差;只有LC/MS/MS法具有高效的分离能力和准确的定性定量能力，被广泛使用，但此法也因为复杂耗时的前处理而被诟病[16]。因此建立一种科学、高效、快速、准确的检测方法十分必要。

材料与方法

仪器与试剂

仪器名称：NexeraX2超高效液相色谱和8045电喷雾三重四级杆质谱仪（日本岛津）、ULPHW-I超纯水机（上海优普）、MTN-2800W氮吹浓缩仪（德国AUTO Science公司）、超声波清洗机（昆山洁力美）、H1850R冷冻离心机（湘仪仪器）、TG16-WS高速离心机（湘仪仪器）、VM-D涡旋混合器（上海皓庄仪器）、JY2002百分之一电子天平（舜守恒平仪器）、肉类绞碎机（嘉厨食品机械）、ATX224万分之一电子天平（日本岛津）;仪器经校准检定合格后方可使用。

标准溶液名称：实验所用β-受体激动剂类标准品：盐酸克伦特罗（Clenbuterol）、莱克多巴胺 （ Racto pamine）、沙丁胺醇（Salbutamol）、特布他林（Terbutaline）、西马特罗（Cimaterol）、氯丙那林（Clorprenaline）、溴布特罗（Brombuterol）、齐帕特罗 （Zilpaterol）、喷布特罗（Penbutolol）、马布特罗（Mabuterol）、妥布特罗（Tulobuterol）、非诺特罗（Fenoterol）采购于曼哈格公司。

同位素内标克伦特罗-D9 （Clenbuterol-D9）、莱克多巴胺-D3 （Ractopamine-D3）、沙丁胺醇-D3（Salbutero1-D3），购于Dr .Ehrenstorfer公司。

实验试剂与耗材：乙腈（上海安谱公司，色谱纯）、甲醇（上海安谱，色谱纯）、乙酸（山东西亚，色谱纯）、甲酸（山东西亚，色谱纯）、无水硫酸镁（国药集团，分析纯）、无水硫酸钠（国药集团，分析纯）、乙酸铵（国药集团，分析纯）、乙二胺四乙酸二钠（国药集团，分析纯）、C18填料（天津博纳艾杰尔）， 粒径40-60μm、PSA填料（天津博纳艾杰尔）， 粒径40-60μm、GCB填料（天津博纳艾杰尔），粒径40-60μm;

方法

實验色谱和质谱条件

色谱条件为：色谱柱： C18色谱柱， 规格2.1×100mm，粒径1.9μm;柱温：32℃;进样体积：2μL;流速：0.3mL/min;流动相A是体积浓度为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸水溶液[17]，洗脱梯度，洗脱条件见表1;所述初始流动相是体积比为9：1的0.1%甲酸水溶液和乙腈的混合液;

质谱条件为：雾化气流速：3.0L/min;干燥气流速：10.0L/min;加热气流速：10.0L/min;DL管温度250℃[18];加热气温度：350℃;接口电压：4000V;离子源类型：电喷正离子模式;扫描方式：多反应监测扫描;氦气作为碰撞气，雾化气和加热气均为氮气，干燥气为洁净空气，各个物质及内标物的主要质谱参数见表2：

标准溶液的制备

混合标准工作溶液：分别称取10mg的盐酸克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、西马特罗、氯丙那林、溴布特罗、齐帕特罗、喷布特罗、马布特罗、妥布特罗、非诺特罗12种β-受体激动剂，用甲醇溶解并定容至100mL，此贮备液浓度为100mg/L，得到混合标准贮备液，用0.1%甲酸水-乙腈（9：1）来稀释混合标准贮备液，配制混合标准工作溶液，浓度梯度为0.1ng/mL，0.2ng/mL，0.5ng/mL，1.0ng/mL，2.0ng/mL，5.0ng/mL，10.0ng/mL，且每个浓度梯度中均加入有6ng的同位素内标物， 同位素内标物由质量比为1：1：1的克伦特罗-D9、莱克多巴胺-D3和沙丁胺醇-D3组成。