pH响应型六臂星形共聚物的制备及药物控释研究

姚琳 余丽丽 马薇 寇佳辉 申婷婷

摘      要：通过开环聚合（ROP）和原子转移自由基聚合（ATRP）设计合成了两种两亲性六臂星形共聚物聚己内酯-b-聚甲基丙烯酸羟基乙酯（6sPCL-b-PHMEA）和聚己内酯-b-聚甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯-b-聚甲基丙烯酸羟基乙酯（6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA）。采用傅立叶变换红外光谱（FT-IR）和动态光散射技术（DLS）研究了共聚物的结构和胶束的粒径，并以阿霉素（DOX）为模型药物考察了两种胶束的药物控释动力学。结果表明：两种胶束均具有合适的粒径，可作为DOX载体，6sPCL-b-PHEMA和6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA胶束的载药量分别为11.56%和14.23%。体外释药实验结果表明，与二嵌段星形共聚物相比，三嵌段星形共聚物具有显著的pH敏感性，pH值从7.4降至2.2时，胶束中DOX的累积释药率显著增大。这种pH响应的六臂星形共聚物具有潜在的抗癌药物控释应用前景。

关  键  词：星形共聚物;原子转移自由基聚合;酸敏感;药物控释

中图分类号：TQ 314        文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）09-1884-05

Abstract： Two amphiphilic six-arm star copolymers poly（ε-caprolactone）-b-poly（hydroxyethyl methacrylate） （6sPCL-b-PHMEA） and poly（ε-caprolactone）-b-poly（diethylaminoethyl methacrylate）-b-poly（hydroxyethyl methacrylate （6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA） with pH-responsive were designed and synthesized by ring-opening polymerization （ROP） and atom transfer radical polymerization （ATRP） process. The structure of the copolymers and the particle size of macromolecular micelles were investigated by Fourier transform infrared spectroscopy （FT-IR） and dynamic light scattering （DLS）， and the drug delivery capacities of the two micelles were detected using adriamycin （DOX） as the model drug. The results showed that， the both micelles had appropriate particle size and could be used for DOX carrier， the DLC of 6sPCL-b-PHEMA and 6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA micelles were 11.56% and 14.23%， respectively. The release process showed that， comparing to the diblock star copolymer， triblock star copolymer had more significant pH-sensitivity. The release of DOX from micelles was enhanced with the pH decreased from 7.4 to 2.2. The pH-sensitive six-arm star copolymer might possess potential application for anticancer drug delivery.

Key words： Star copolymer; Atom transfer radical polymerization; pH Sensitive; Controlled drug delivery

兩亲性聚合物含有疏水性和亲水性结构，可通过自组装形成具有“核-壳”结构的聚合物胶束，因具有低毒性、血液循环长、可溶解疏水性药物和高度内化等优点，广泛用于药物载体的研究[1-2]。由于胶束的纳米尺寸效应，聚合物胶束可通过被动或主动靶向作用富集在肿瘤部位（EPR效应），实现抗肿瘤药物的特异性释放，有效地抑制肿瘤生长[3]。为了提高化疗药的疗效、控制毒副作用等可通过肿瘤组织和正常组织的差异，如pH[4-5]、还原型谷胱甘肽（GSH）[6]、温度[7]等，设计一系列的刺激响应型智能聚合物胶束，这类胶束可在正常生理条件下稳定存在，而在肿瘤部位环境下达到药物的快速释放[8]。

在对载体材料的研究中，星形聚合物作为一类高度支化聚合物，以多功能支化点为“核”，以核发射出的若干线性链作为“臂”，这种独特的结构使其具有与线性聚合物完全不同的理化性质[9]。星形聚合物具有独特的结构，其链相对较短，但相对分子质量较高，形状不规则紧凑，功能基团相对于线性聚合物更多，因此具有溶解性增强、低黏度、低结晶性和高稳定性[10]。通常采用生物相容性/可降解聚合物分支组成星形结构，如聚丙交酯（PLA）、聚己内酯（PCL）、聚乙二醇（PEG）、聚甲基丙烯酸羟基乙酯等制成具有两亲性的核壳结构的大分子聚合物，用于疏水性药物分子的包载/控释[11]。

据此，本文通过开环聚合（ROP）和原子转移自由基聚合（ATRP），设计合成了两种两亲性六臂星形聚己内酯-b-聚甲基丙烯酸羟基乙酯（6sPCL-b-PHMEA）和聚己内酯-b-聚甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯-b-聚甲基丙烯酸羟基乙酯（6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA），将星形共聚物在水溶液中组装成大分子胶束，研究其载药性能及在不同pH环境下的药物控释动力学。

1  实验部分

1.1  仪器与试剂

TENSOR 27傅里叶变换红外光谱仪，德国布鲁克公司;LS55荧光分光光度计，美国Perkin Elmer 公司;Nano ZS ZEN3600马尔文激光粒度仪，英国马尔文仪器;FD-1000冷冻干燥机，东京理化器械株式会社;DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司;RE-2000A旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司;SHA-C数显水浴恒温振荡器，常州国华电器有限公司。

ε-己内酯（ε-CL，99%）、2-溴异丁酰溴（98%）、五甲基二乙烯基三胺（PMDETA，99%）、甲基丙烯酸羟基乙酯（HEMA，98%）、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯（DEAM，99%）、盐酸阿霉素（DOX?HCl，98%）、辛酸亚锡[Sn（Oct）2，95%]和CuBr，购自阿拉丁试剂有限公司;双季戊四醇（98%），购自上海麦克林生化科技有限公司;常规试剂如二氯甲烷（DCM）、四氢呋喃（THF）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基亚砜（DMSO）等，均为分析纯。

1.2  实验方法

1.2.1  星形共聚物6sPCL-b-PHEMA的制备

1）羟基封端聚己内酯（6sPCL-OH）的合成（采用ROP法）：将0.085 g双季戊四醇、4.43 mL ε-CL和Sn（Oct）2（质量分数为0.1%的ε-CL）加入50 mL烧瓶中减压干燥2 h，氮气保护下将混合物在120 ℃反应24 h。结束后用少量DCM溶解，冷甲醇沉降3次，将沉淀真空干燥得6sPCL-OH 3.84 g。

2）溴封端聚己内酯（6sPCL-Br）的合成：将2.5 g 6sPCL-OH溶于35 mL DCM，加入1.0 mL三乙胺，冷却至0 ℃，在氮气保护下将溶于10 mL DCM的异丁酰溴（1.0 g）溶液缓慢滴加至上述混合液中，室温搅拌48 h。反应结束后，分别用5% NaHCO3（3×30 mL）和饱和NaCl溶液（3×30 mL）洗涤，无水硫酸钠干燥，冷石油醚沉降3次，真空干燥得到产物6sPCL-Br 2.12 g。

3） 6sPCL-b-PHEMA的合成（采用ATRP法）：在Schlenk瓶中依次加入0.20 g 6sPCL-Br，4 mL  1，4-二氧六环，0.04 g CuBr，HEMA 0.30 g和42 ?L PMDET后将混合物冷冻-抽真空-充氮气-解冻循环3次，60 ℃反应24 h，反应结束后，通空气淬灭反应。以DCM为洗脱剂，通过中性氧化铝柱除去CuBr，减压除去溶剂，用冷石油醚沉降3次，真空干燥得产物6sPCL-b-PHEMA（图1a） 0.207 g，保存备用。

1.2.2 星形共聚物6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA的制备

以6sPCL-Br为引发剂，DEAM为功能性单体，CuBr为催化剂，PMDETA为配体，通过ATRP反应合成6sPCL-b-PDEAM;以6sPCL-b-PDEAM为引发剂，HEMA为单体，CuBr为催化剂，PMDETA为配体，合成6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA（图1b）。具体方法同1.2.1中第3种，经过两次ATRP反应，最终得到产物0.122 g，保存备用。

1.3  大分子胶束的构建

分别将两种星形共聚物（1 mg 6sPCL-b- PHMEA和1 mg 6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA）溶解并分散于1 mL THF中，并在室温下搅拌30 min，缓慢滴加400 μL蒸馏水以形成胶束，继续搅拌30 min后加入4 mL水，减压浓缩除去THF和部分水，将体积定容至2 mL，得空白胶束。

1.4  胶束的载药性能

1.4.1  载药量的测定

以DOX为模型药物制备载药胶束：分别将10 mg两种星形共聚物溶于250 μL DMF和750 μL THF混合溶剂中;将3 mg DOX?HCl溶于250 μL DMF中，再加入一滴TEA中和HCl;将上述DOX的DMF溶液与聚合物溶液混合并搅拌10 min，缓慢滴入5 mL水中搅拌30 min形成聚合物胶束，减压除去THF。将溶液转移到透析袋中（截留相对分子质量       8 000 ～14 000），在蒸馏水中透析12 h以去除未包载药物和溶剂，最后定容至10 mL。

取0.2 mL载药胶束加入2 mL混合溶剂      [V（DMF）∶V（DMSO）=1∶1]充分溶解，采用荧光分光光度计测定胶束载药量，定激发波长为   470 nm，测定发射波长588 nm处的荧光强度。按公式（1）计算载药胶束的载药量（Y1）。

1.4.2 载药胶束的体外释药性能

以pH為7.4、5.0、2.2三种缓冲液作为释放介质，考查载药胶束的释药动力学：分别将2 mL二嵌段、三嵌段载药胶束转移到透析袋中（截留相对分子质量8 000～14 000），放入20 mL透析液，在37 ℃下进行药物释放，每隔一段时间取2 mL透析液，并补充等量的释放介质，用荧光分光光度计测定DOX的累积释放量，以时间为横坐标，累积释药率为纵坐标，绘制药物释放动力学曲线。

1.5  结构表征

红外表征：分别取微量样品与光谱纯溴化钾充分研磨后压片，通过傅里叶变换红外光谱仪测定其FT-IR。

粒径和粒径分布（PDI）：取1 mL空白胶束用水定容至100 mL，超声30 min，采用马尔文激光粒度仪测定其粒径及粒径分布。

2  结果与讨论

2.1  FT-IR表征

图2为星形共聚物各步产物的FT-IR图，从图谱中可以看到3 400 cm-1附近的宽吸收带为—OH的特征峰，2 850～2 950 cm-1为—CH2上C—H的反对称伸缩和对称振动峰，1 700 cm-1附近为酯羰基伸缩振动峰，1 360～1 450 cm-1为—CH2上C—H的变角振动峰，1 150～1 290 cm-1为CH2烷烃扭曲振动峰，    723 cm-1为4个以上CH2链具有的特征峰。6sPCL-b- PHEMA图谱中可以明显看到—OH特征峰变宽、变强，证明了HEMA单体的引入，6sPCL-b-PDEAM -b-PHEMA图谱中也有相应基团的特征吸收峰，如羰基、CH2、CH3、—OH等，C—N伸缩振动在        1 230～1 030 cm-1区域，与CH2特征峰重叠。

2.2  胶束的粒径和粒径分布

图3为两种共聚物胶束的粒径分布图，其中二嵌段胶束平均粒径为205.0 nm（PDI=0.135），三嵌段胶束平均粒径为230.4 nm（PDI=0.180），可见两种胶束粒径分布较为均匀，并且这些胶束大小允许通过EPR效应在肿瘤中外渗和积聚，可用于抗癌药物的释放。三嵌段共聚物胶束的粒径略大于二嵌段共聚物胶束，这可能是由于DEAM的加入导致胶束粒径的增大。

2.3  胶束的载药性能

实验采用透析法制备了载药胶束，并采用荧光分光光度法测定胶束载药量，其中DOX在混合溶剂[V（DMF）∶V（DMSO）=1∶1]中的标准曲线为I = 8.813 9ρ+7.959 4 （r =0.998 4），线性范围为0～20 μg·mL-1。利用DOX在混合溶剂中的标准曲线和公式（1）测得6sPCL-b-PHEMA和6sPCL-b-PDEAM- b-PHEMA载DOX胶束的载药量分别为11.56%和14.23%。结果表明，三嵌段聚合物的载药量高于二嵌段聚合物，这可能由于DEAM是疏水基，增加了结构中疏水链的长度从而提高载药量。

2.4  pH敏感药物释放性能

采用荧光分光光度法测定胶束的累积释药率，其中DOX在水溶液中的标准曲线为I=60.503 9ρ+ 7.448 7（r =0.997 8），线性范围为0～10 μg·mL-1。图4为不同pH介质下DOX从两种载药胶束中释放的动力学过程，可见，pH的变化对二嵌段胶束的药物释放影响较小，而对三嵌段胶束的药物释放有显著影响，随着pH值从7.4降至2.2，三嵌段胶束的DOX累积释药率逐渐增加，在pH=2.2时14 h累积释药率可达到约80%，具有显著的酸敏感性。这是由于在酸性条件下可使DEAM中的叔胺基团发生质子化，增加了胶束尺寸，进而导致DOX的释放速率加快。

3  结 论

1）采用ROP和ATRP反应合成了两种两亲性六臂星形共聚物6sPCL-b-PHMEA和6sPCL-b- PDEAM-b-PHEMA，并通过FT-IR对其结构进行了表征。

2）两种共聚物能在水介质中自组装成胶束，均具有合适的粒径和粒径分布，采用透析法将DOX载入聚合物胶束，测得6sPCL-b-PHEMA和6sPCL- b-PDEAM-b-PHEMA胶束的载药量分别为11.56%和14.23%。

3）研究了不同pH介质（pH=7.4、5.0、2.2）环境下两种载药胶束的释放动力学，研究发现，与星形共聚物6sPCL-b-PHEMA相比，星形共聚物6sPCL-b-PDEAM-b-PHEMA具有显著的pH敏感性。

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