利拉鲁肽通过下调TGF-β1和α-SMA对慢性肾功能衰竭大鼠的治疗作用

陈丽 唐文庄 朱美娟 陈娟

570102 海口，海南医学院第一附属医院血液净化科

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)定义为估算肾小球滤过率<15 mL/min·(1.73 m2)-1，其特征在于肾小球硬化，肾小管萎缩以及不可逆和进行性肾单位丢失，这与严重的肾脏损害和一系列代谢紊乱有关，被认为是最常见的死亡原因之一[1-2]。血液透析或肾脏移植是治疗CRF的有效策略，但是全球每年仍有近320万患者死亡[3]。因此，迫切需要进一步阐明CRF的分子机制以寻找新的治疗策略。

转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)作为肾小球系膜细胞增生的有效刺激剂，是导致纤维化过程的重要因素之一[4-5]。研究发现TGF-β1的上调会导致CRF中肾功能的损害[6]。

α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是平滑肌细胞和成肌纤维细胞的标志蛋白。据报道，肾脏中高水平的α-SMA表达是肾小管上皮-成肌纤维细胞转分化的标志[7]。此外，肾小球膜细胞活化的特征是诱导α-SMA表达，从而进一步促进了细胞外基质的沉积和肾小球硬化[8]。

利拉鲁肽(liraglutide)是一种胰高糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)类似物，用于治疗糖尿病[9]。GLP-1受体(GLP-1 receptor，GLP-1R)在肾小球血管内皮细胞中大量表达[10]，提示利拉鲁肽可能对肾脏有保护作用。

本研究中，通过建立CRF大鼠模型研究利拉鲁肽对TGF-β1和α-SMA表达的影响，进一步探讨利拉鲁肽对肾脏保护潜在的分子机制。

材料与方法

一、材料

1.动物 40只成年雄性Wistar大鼠(SPF级，220～240 g)购自海南医学院实验动物中心。实验大鼠饲养于标准动物房中，正常饮食饮水，实验动物设计严格经过我院伦理委员会审查(编号：20170816)。大鼠适应环境两周后进行实验。

2.试剂 利拉鲁肽购自丹麦诺和诺德公司。24 h尿蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所。BUN和Scr测定试剂盒购自瑞士罗氏公司。HE试剂盒、DAB显色盒和Masson试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。大鼠一氧化氮(NO)试剂盒、大鼠丙二醛(malondialdelyde,MDA)试剂盒、大鼠过氧化氢酶(catalase,CAT)试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司。RIPA裂解液和BCA试剂盒购自美国promega公司。兔抗TGF-β1抗体、兔抗α-SMA抗体、兔抗β-actin抗体和山羊抗兔IgG抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

二、方法

1.大鼠慢性肾功能模型制备 造模：大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠进行麻醉后，暂时阻塞肾动脉，结扎并切除2/3左肾。通过压迫控制出血，直到停止。用聚丙烯缝合线闭合肌肉和皮肤切口。一周后，切开右腹，将肾血管和输尿管绑扎，并切除右肾[2]。

2.分组及给药 (1)分组：Wistar大鼠Wistar大鼠称重, 依次编号, 以体重升序排序, 依体重顺序将大鼠分成若干个区组。用Excel软件对每个区组大鼠的体重产生1个随机数, 各个区组以随机数升序排序, 以随机数的顺序将每只大鼠分入到4个组中：分为假手术组(sham组)、慢性肾功能衰竭组(CRF组)、利拉鲁肽低剂量组(Liraglutide-L组)和利拉鲁肽高剂量组(Liraglutide-H组)，共4组,每组10只。CRF组、Liraglutide-L组和Liraglutide-H组大鼠按1∶2∶1进行CRF模型制作，sham组大鼠只暴露肾脏，不切除肾组织，将其包膜及周围脂肪组织剥离后关腹。(2)给药：给药方式为腹腔注射；给药时间在CRF造模第3天。造模成功后，sham组注射无菌生理盐水，4 mL/kg；CRF组注射无菌生理盐水，4 mL/kg；Liraglutide-L组注射0.1 mg/kg的利拉鲁肽，给药体积为4 mL/kg；Liraglutide-H组注射0.3 mg/kg的利拉鲁肽，给药体积为4 mL/kg[9]。每天给药2次，连续12周。

3.大鼠24 h尿蛋白定量测定 收集各组大鼠24 h尿液，采用双缩脲法测定大鼠24 h尿蛋白定量。计算公式为：24 h尿蛋白定量=尿蛋白浓度×24 h尿量。

4.大鼠血清Scr和血清BUN水平测定 各组大鼠经3%戊巴比妥钠麻醉后，于心尖取血，并置于1.5 mL EP管中，3 000 r/min 离心15 min，离心半径5 cm，吸取上层血清，应用全自动生化分析仪检测各组大鼠Scr和BUN水平。

5.HE染色 切取新鲜肾组织，经固定、常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，并制成4 μm的石蜡切片。按HE染色步骤经脱蜡、脱水、染色、冲洗、中性树胶封片，镜下观察肾组织的病理变化。

6.酶联免疫吸附试验 将各组大鼠肾组织放入9倍体积的磷酸缓冲盐溶液中，用匀浆器分散到匀浆中，冻融3次，并在4 ℃以3 000 r/min 离心15 min，收集上清液。按照ELISA试剂盒说明书进行操作，用酶联仪在450 nm波长依序测定各孔的光密度(OD值)，根据OD值所绘制的标准曲线查出肾组织中NO、MDA和SOD的表达。

7.免疫组织化学 肾组织经固定，包埋，石蜡切片,脱水,缓冲液清洗，3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，滴加非免疫动物血清20 min，滴加一抗,磷酸缓冲盐溶液冲洗,滴加二抗,冲洗后加亲和素-生物素-过氧化物酶复合物,3，3-二氨基苯联胺(diaminobenzidine，DAB)显色，中性树胶封片。在显微镜下观察，用MIAS图像分析系统分析，按照免疫组化染色阳性细胞数在每一高倍视野中所占比例依次统计。目标蛋白呈棕黄色，则为阳性表达。

三、统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据分析，正态分布数据资料以Mean±SD表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，率的比较采用χ2检验。检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、大鼠的一般情况

结果如表1所示，在造模过程中，1只大鼠死亡。在实验期间，sham组大鼠饮食正常，皮毛茂密有光泽，体重迅速增加；CRF组大鼠皮毛枯萎，没有光泽、食欲不振，体重明显减轻(P<0.01)；Liraglutide-L组和Liraglutide-H组大鼠较CRF组大鼠相对活跃，体重相对增加(P<0.05)；与Liraglutide-L组比较，Liraglutide-H组大鼠体重增加更快(P<0.05)。

二、利拉鲁肽对CRF大鼠肾功能的影响

结果如表2所示，与sham组比较，CRF组BUN、Scr及24 h尿蛋白定量明显升高(均P<0.01)；与CRF组比较，Liraglutide-L组和Liraglutide-H组BUN、Scr及24 h尿蛋白定量下降(均P<0.05)。

表1 利拉鲁肽对CRF大鼠死亡率和体重的影响

三、利拉鲁肽对CRF大鼠肾组织氧化应激的影响

ELISA结果表明(图1)，与sham组比较，CRF组大鼠肾组织中NO、CAT的含量显著降低(均P<0.001)，MDA的含量显著升高(P<0.001)；与CRF组比较，Liraglutide-L组和Liraglutide-H组大鼠肾组织中NO、CAT的含量升高(均P<0.05)，MDA的含量下降(P<0.05)，且Liraglutide-H组作用效果更明显(均P<0.05)。

四、利拉鲁肽对CRF大鼠肾组织病理变化的影响

HE结果表明(图2)，sham组大鼠肾组织的肾小球、肾小管是正常的；CRF组大鼠肾组织间质区域的局灶性病变、间质性炎症和肾小管萎缩；而Liraglutide-L组和Liraglutide-H组大鼠肾组织形态得到了很大改善，如局灶性病变数量减少，间质炎症减弱和适度的肾小管萎缩，其中Liraglutide-H组大鼠肾组织形态改善情况较Liraglutide-L组明显。

五、利拉鲁肽对CRF大鼠肾组织中TGF-β1表达的影响

免疫组织化学染色显示(图3、4)，与sham组比较，CRF组大鼠肾组织中TGF-β1的表达显著上调(P<0.001)；与CRF组比较，Liraglutide-L组和Liraglutide-H组大鼠肾组织中TGF-β1的表达下调(P<0.05)，且Liraglutide-H组作用效果更明显(P<0.05)。

六、利拉鲁肽对CRF大鼠肾组织中α-SMA表达的影响

免疫组织化学染色显示(图5、6)，与sham组比较，CRF组大鼠肾组织中α-SMA的表达显著上调(P<0.001)；与CRF组比较，Liraglutide-L组和Liraglutide-H组大鼠肾组织中α-SMA的表达下调(P<0.05)，且Liraglutide-H组作用效果更明显(P<0.05)。

表2 利拉鲁肽对CRF大鼠肾功能的影响

注：与sham组比较，a P<0.001；与CRF组比较，b P<0.05，c P<0.01；与Liraglutide-L组比较，d P<0.05。图1 各组大鼠肾组织中NO、MDA和CAT的表达比较 1A.NO;1B.MDA;1C.CAT

图2 各组大鼠肾组织病理变化(HE染色,200×) 2A.sham组;2B.CRF组;2C.liraglutide-L组;2D.lin glutide-H组

图3 各组大鼠肾组织中TGF-β1的表达(免疫组织化学染色,400×) 3A.sham组;3B,CRF组;3C.liraglutide-L组;3D.liralutide-H组

注：与sham组比较，a P<0.001；与CRF组比较，b P<0.05，c P<0.01；与Liraglutide-L组比较，d P<0.05。图4 各组大鼠肾组织中TGF-β1的表达比较

图5 各组大鼠肾组织中α-SMA的表达(免疫组织化学染色,400×) 5A.sham组;5B.CRF组;5C.Liraglutide-L组;5D.Liraglutide-H组

注：与sham组比较，a P<0.001；与CRF组比较，b P<0.05，c P<0.01；与Liraglutide-L组比较，d P<0.05。图6 各组大鼠肾组织中α-SMA的表达比较

讨 论

CRF对人类健康构成严重威胁，为了更好地了解其发病机制并确定有效的治疗方法，通常将5/6肾切除术大鼠模型用于模拟CRF的过程[11]。5/6肾切除后，肾脏形态发生病理改变，包括肾间质纤维化和肾小管萎缩，最终导致CRF[12- 13]。目前已有多种药物对CRF有一定的治疗作用，如红景天苷[14]、黄连碱[15]等，但是利拉鲁肽对CRF保护作用尚不清楚。

氧化应激标记物是一系列生物化学物质，可反映体内氧化应激水平[16]。其中，ROS、活性氮和脂质过氧化物常用于CRF检测，氧化应激标志物的测定在揭示CRF的发生和发展与氧化应激的相关性中起着重要的作用[17]。汪卫红等[18]研究发现，与对照组比较，CRF模型组大鼠肾组织MDA含量升高，而SOD、CAT活性均显著降低。在本研究中，我们发现CRF组大鼠肾组织中NO、CAT的含量显著降低，MDA的含量显著升高。

TGF-β1是一种多功能细胞因子，参与多种生理和病理过程，例如平滑肌分化、上皮-间质转化和组织纤维化[19]。众所周知，TGF-β1主要负责慢性肾脏疾病中纤维化的增加[20]。体内和体外研究表明，TGF-β1还通过激活肾小球系膜细胞并随后促进细胞外基质的积累而促进了肾小球硬化的病理[21-22]。另一方面，α-SMA是平滑肌细胞和成肌纤维细胞的常见标志物，在肾脏中高度表达，而α-SMA的过度生产部分是由于肾小管上皮-成纤维细胞转分化，其在肾间质纤维化中起重要作用[23]。于艳等[24]研究表明，CRF大鼠肾组织中TGF-β1和α-SMA蛋白表达增加。在本实验中，CRF组大鼠肾组织中TGF-β1和α-SMA表达显著上调，与上述文献报道一致。

利拉鲁肽的作用机制广泛，具有降低血糖、保护心脏和抑制炎症反应等作用[25]。研究发现，利拉鲁肽对糖尿病肾病有一定的治疗作用[26]，我们猜想利拉鲁肽是否对CRF有治疗作用，本实验中发现，利拉鲁肽降低了CRF大鼠肾功能指数提高，肾组织中NO、CAT的含量升高，MDA的含量降低；肾组织形态得到了很大改善，如局灶性病变数量减少，间质炎症减弱和适度的肾小管萎缩；且大鼠肾组织中TGF-β1和α-SMA表达下调；而且高剂量利拉鲁肽的作用效果比低剂量利拉鲁肽的作用效果更明显。因此，利拉鲁肽对CRF有一定治疗作用。

综上所述，利拉鲁肽对CRF有一定的治疗作用可能与减轻氧化应激反应、下调TGF-β1和α-SMA的表达有关，但是具体的机制要更进一步的研究。