外泌体对骨愈合作用的研究进展

王特，蔡乐益，卢迪，陈华

（温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 创伤骨科，浙江 温州 325027）

在社会经济现代化发展下，创伤性骨折的发生率显著增高，据报道由交通事故因素导致的骨折占总体因素的45%[1]。骨折不愈合是骨折临床治疗中的严重并发症之一，同时也是目前研究的热点问题。据统计有5%～10%的骨折可能发展成为骨折不愈合，从而使患者恢复功能的时间增加，造成患者经济负担及医疗资源的浪费[2]。此外，糖尿病性和老年性骨质疏松的增加也能导致骨微结构的破坏，显著增加骨折风险，同时也影响骨折愈合的过程[3]。因此，如何有效地促进骨折愈合，治疗骨折不愈合仍是所有骨科医师面临的巨大挑战。

近年来，越来越多的研究指向具有多种生理功能的外泌体领域。外泌体由活体细胞分泌产生，其起源于晚期细胞内吞体囊泡，与细胞膜融合后往外释放的膜性囊泡，多种细胞均能分泌，内含有特定的蛋白质、脂质、细胞因子或遗传物质，直径40～100 nm[4-5]。研究表明，外泌体通过介导不同细胞间的通讯参与呈递抗原、影响肿瘤细胞生长、促进组织修复等多种病理生理学过程，能够有效刺激机体器官、组织，包括心脏、肺脏、肾脏、骨组织、肉芽组织等的再生，在特定疾病的早期诊断、治疗及精准化靶向治疗等方面展现出较大的优势[6-10]。本文将近年来外泌体在骨组织、血管骨骼肌等方面的文献报道加以整理，以期为外泌体的基础研究与临床应用提供参考。

1 外泌体的基本概要

1983年，在绵羊网织红细胞中首次发现了外泌体[11-12]，1987年JOHNSTONE等[13]将这种特异性囊泡命名为“exosome”。最初，学者认为这种膜性囊泡是一种实验的人工成分、废弃物或者机体坏死细胞的残留组织[11]。直到20世纪90年代，ZITVOGEL等[14]和RAPOSO等[15]报道指出外泌体极有可能是不同细胞之间参与通讯的一种方式。

不同细胞分泌的外泌体含有特异性蛋白分子（Alix、LAMP-2、CD63、CD9、Flotillin-1等），同时还包含许多关键分子，发挥不同的功能[16]。通过外泌体脂质膜中具有识别作用的蛋白，能够识别不同的靶向细胞，从而发挥生理作用，因此可以运载特定的药物，靶向介导治疗特定的疾病。然而在机体处于损伤状态中或者外界不良的刺激等病理情况下，细胞产生的外泌体也会产生不利影响，加大损失，甚至加快疾病进程[17]。

据目前研究显示，人类间质充干细胞分泌的外泌体参与保护心肌缺血再灌注损伤[18]，缓解肢体缺血[19]，促进创口愈合[20]，调节移植物抗宿主 病[21]，缓和肾脏损伤[22]，刺激肝脏再生[23]，抑制肺高压[24]，促进视网膜修复[25]，参与软骨组织[26]和骨组织再生[19]。

2 外泌体的提取与鉴定

人体体内多种细胞能够分泌外泌体，如网织红细胞[11]、树突状细胞[27]、B细胞[15]、T细胞[28]、肥大细胞[29]、上皮细胞[30]和肿瘤细胞[31]。通过运输特定的编码RNA[32]、非编码RNA[33]、蛋白质[34]、抗原呈递分子[35]和DNA[36]，外泌体参与细胞间的通讯，保护特定内容物，以调节机体不同细胞的活性。

目前，外泌体提取方法较多，方式各具特 色[37-40]。提取外泌体的方法、具体提取原理及其优缺点见表1。通常采用以下方法鉴定所提取的外泌体。第一种是电镜下直视外泌体的形态。将提取所得的外泌体溶液滴加至100目载样铜网上，静置于室温中1 min，后滴加染色剂（磷钨酸钠溶液或乙酸双氧铀溶液），染色1 min后即可观察。第2种是免疫学方法。采用流式细胞术、Western blot、ELISA等方法检测外泌体表面特异蛋白膜，如转运融合蛋白、热休克蛋白、CD9、CD63等，根据测定抗原抗体复合物上的特殊标记的量即可得知所检测外泌体量。另外还可以采用PCR法、原子力显微镜、图像流技术等[41]。目前方法较多，研究中常常会采用2～3种方法联合测定，保证外泌体的纯度。

表1 外泌体的提取方法总结

3 外泌体在成骨、破骨细胞中的作用

近年来，越来越多的学者报道了骨重建过程中外泌体发挥的作用。在骨愈合的微环境中，参与骨愈合的细胞通过分泌细胞因子调控重建过程。BEHERA等[42]研究指出，骨髓间充质干细胞通过分泌特异性外泌体，将不同的生物活性蛋白运输至靶向细胞，从而介导骨微环境中细胞的交流，尤其是成骨细胞和破骨细胞。

CUI等[43]将矿化的前成骨细胞产生的外泌体与骨髓基质细胞共同培养，结果发现骨髓基质细胞表面出现成骨标志。通过上调Runx2、ALP的表达，发现骨髓基质细胞的矿化程度也能够增加，因此得出外泌体介导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的过程，参与机体骨重塑的机制中。同时他发现，MC3T3-E1细胞的外泌体能影响靶向细胞的miRNA，抑制Axin1表达和促进β-连环蛋白表达，进而通过Wnt促进骨髓基质细胞的成骨分化。XU等[44]也发现，C2C12肌母细胞来源的外泌体激活了Wnt/β-连环蛋白通路，促进了成骨细胞的分化。该特异性外泌体内含有miRNA等物质，其中的miR-27a-3p介导抗原呈递 细胞的表达，成为促进成骨的主要成分。QIN等[45]研究发现，骨髓间充质干细胞分泌的外泌体含有参与成骨的miR-196a、miR-27a、miR-206，通过信号呈递介导骨细胞的分化，指出外泌体可以促进成骨细胞分化，刺激骨组织的再生，但通过体外实验发现对成骨细胞增殖没有明显影响。

SUN等[46]发现，破骨细胞能够分泌含有特异性miRNA的外泌体，其通过调节剂miR-214介导Runx和β-连环蛋白等通路，参与成骨细胞的分化过程。LI等[47]通过人体内提取外泌体，在小鼠模型中进行了体外实验以及基因检测，得出了类似的结论，指出富含miR-214的外泌体不仅能够抑制破骨细胞，也能够促进成骨细胞的骨形成。

4 外泌体在血管和骨骼肌中的作用

在骨折的同时通常会伴随附近血管肌肉的损伤，骨折能否顺利愈合与血管的重建再生相关。大量的研究报道指出血管和骨骼肌的再生与外泌体密切相关。BIAN等[48]将间充质干细胞来源的外泌体用于急性心肌梗死大鼠模型，发现大鼠梗死的心肌血流显著改善，梗死范围明显减少，表明外泌体在促血管生成活性中发挥重要作用。NAKAMURA等[49]发现，骨髓间充质干细胞分泌的外泌体中富含miR-494，通过miRNA的表达，尤其是miR-494，参与促进肌肉、血管的再生。CHOI等[50]通过小鼠实验发现骨骼肌成肌细胞来源的外泌体含有多种信号分子，如胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子-2等，通过早期与邻近细胞融合，表现出类似于肌小管一样的表型，增加了肌球蛋白的表达。另外，他通过体外实验发现，骨骼肌成肌细胞来源的外泌体也能够增加肌纤维的数量，从而显著增加骨骼肌的再生。

目前关于外泌体及其携带的miRNA如何介导血管肌肉损伤的修复的具体机制及信号通路尚不明确，同时笔者也检索了国内外多个数据库，发现外泌体与骨骼肌损伤修复的报道较少，因此这可能能够成为将来外泌体研究的一个方向，同时对血管骨骼肌损伤修复的治疗也提供了一个新的突破口。

5 外泌体在软骨再生中的作用

ZHANG等[26]通过在体实验首次提出间充质干细胞来源的外泌体能够参与骨软骨的修补。在该研究中，间充质干细胞来源的外泌体加速了新组织填充，增强 II型胶原基质合成和硫酸化糖胺聚糖，到实验结束时，实验动物的软骨成分完全恢复，与年龄匹配的对照组相类似。然而在对照组中，仅仅发现纤维性修复，并无软骨成分。外泌体包含多种成分，类似miRNA、mRNAs、蛋白质等，这些物质极有可能参与细胞之间的通讯作用，从而发挥不同的功能，参与细胞内不同的进程。尽管参与软骨修补特定的物质未被找到，但是外泌体确实能够发挥参与骨组织以及软骨组织修复重建的作用。SUN等[51]发现，相对于对照组，从高表达miR-320人骨髓间充质干细胞提取的外泌体更能够促进关节骨软骨细胞的增殖，下调MMP-19等，认为这种特定的外泌体或许能成为一种新的治疗方案。

6 展望

目前，尽管外泌体广泛存在，通过体内、体外实验不难发现在一定条件下能够参与促进软骨细胞和成骨细胞生成，然而将外泌体作为一种治疗方案，尚未见临床研究报道，也没有解决方案。相信在外泌体研究不断深入的前提下，其在骨折愈合领域中的应用前景将更加广阔。在体外可以通过细胞来源或者基因工程等方式大规模进行扩大生产，从而更加广泛地应用于临床。在促进骨折愈合方面，外泌体可能是一种更加有效、方便、安全的治疗方案。